PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp Mega-PCR

Mega-PCR là kĩ thuật cải biến trình tự gen thơng qua việc tạo những biến đổi chủ đích sử dụng PCR. Phƣơng pháp cơ bản của kĩ thuật Mega-PCR cần 3 mồi oligonucleotide và hai bƣớc PCR sử dụng khuôn là gen gốc (Hình 2.2). Mồi đột biến đƣợc kí hiệu là M và hai mồi ngồi là R, F. Mồi M có thể thiết kế để thay thế, xóa bỏ, chèn, hoặc tổ hợp các đột biến này, vì vậy, kĩ thuật này có rất nhiều ứng dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp. Bƣớc PCR đầu tiên sử dụng mồi M và mồi F để tạo ra mồi Mega có kích thƣớc khá lớn. Đoạn DNA đƣợc tạo thành từ hai mồi F, M đƣợc tinh chế và đóng vai trị là mồi trong bƣớc PCR thứ hai cùng với mồi R. Sản phẩm PCR lần thứ hai chính là đoạn DNA gốc đã đƣợc cải biến bên trong nhờ mồi M.

Hình 2.2. Phƣơng pháp Mega-PCR cơ bản.

Sản phẩm Mega-PCR sau đó đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5×. Mẫu gồm 5 l sản phẩm PCR đƣợc trộn với 1 l đệm

mẫu có chứa: glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol blue, xylene cyanol và nạp vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 volt cm-1 gel, sau 25 phút, gel đƣợc lấy ra và nhuộm trong dung dịch chứa ethidium bromide (EtBr) trong 10 phút. Gel agarose đƣợc vớt ra và rửa bằng nƣớc để loại bỏ EtBr bám không đặc hiệu. Các băng DNA đƣợc quan sát và chụp ảnh dƣới ánh sáng UV bằng máy soi gel SynGene.

2.2.2. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction Extraction

Bộ kít GenJETTM Gel Extraction đƣợc thiết kế để tinh sạch các phân đoạn DNA từ gel agarose chạy trong đệm TAE hoặc TBE với hiệu suất cao trong thời gian ngắn. Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau:

- Băng DNA quan tâm đƣợc cắt chính xác bằng lƣỡi dao sạch từ gel agarose và đƣợc hòa tan bằng đệm bám (binding buffer) ở nhiệt độ 60 °C trong khoảng 10 phút.

- Dung dịch gel agarose đã hòa tan đƣợc chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm 10000 vòng phút-1 trong 1 phút. Phần dịch đi qua màng đƣợc gạn bỏ.

- DNA đƣợc rửa sạch bằng 500 µl đệm rửa (wash buffer), phần dịch đi qua màng sau khi ly tâm đƣợc gạn bỏ. Bƣớc này đƣợc lặp lại một lần nữa.

- Cột tinh sạch có chứa DNA đƣợc chuyển sang ống Eppendorf 1,5 mới và bổ sung 100 µl elution buffer. Sau đó, DNA đƣợc thu bằng cách ly tâm 1 phút với tốc độ 10000 vòng phút-1. DNA tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20°C.

2.2.3. Ghép nối plasmid

Đoạn DNA sau khi cắt bằng enzyme hạn chế đƣợc nối vào vector cũng đã đƣợc xử lý cùng một enzyme tƣơng ứng theo tỷ lệ nồng độ 3:1. Thành phần của phản ứng trong tổng thể tích 20 μl nhƣ sau: 9 μl H2O (DNase, RNase - free); 2 l

đệm 10 của T4 DNA ligase; 1 l T4 DNA ligase 400 U ml-1; 4 l vector; 4 l

DNA. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 16 C qua đêm (16 giờ). 10 μl sau phản ứng

ghép nối sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt.

2.2.4. Biến nạp sản phẩm ghép nối plasmid vào E. coli bằng sốc nhiệt

Tạo tế bào E. coli DH5α khả biến [50]

Cấy chuyển một khuẩn lạc E. coli DH5α vào 5 ml môi trƣờng LB, lắc 200 rpm ở 37 C qua đêm. Chuyển 0.5 ml dịch tế bào sang 50 ml môi trƣờng LB, tiếp tục

cấy lắc 200 rpm ở 37 C cho tới khi đạt OD600nm từ 0,4 – 0,6. Sau đó lấy mẫu ra và đặt lên đá khoảng 15 phút. Từ bƣớc này tất cả các thao tác đều phải tiến hành ở 4C. Ly tâm 4000 rpm trong 10 phút. Hòa tế bào thu đƣợc trong 50 ml 100 mM CaCl2 lạnh (vô trùng). Ủ mẫu 15 phút và ly tâm thu tế bào ở 3500 rpm/ 10 phút. Hòa tủa trong 25ml dung dịch 100 mM CaCl2, ủ mẫu trong 60 phút trên đá. Ly tâm 4000 rpm/ 10 phút/ 4C. Hòa tế bào trong 0,5 ml dung dịch 100 mM CaCl2, bổ sung 15% glycerol. Hút 0,1 ml dịch tế bào trên vào mỗi ống Eppendorf sử dụng trực tiếp hoặc bảo quản ở -75 C.

Biến nạp bằng sốc nhiệt [50]

Tế bào khả biến đƣợc lấy ra từ tủ -75 C, làm tan trên đá trong khoảng 15 phút. Sau đó bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 10 - 100 ng DNA, đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đó để mẫu trên đá trong 30 phút. Mẫu đƣợc chuyển ủ ở 42C trong 90 giây. Sau đó, mẫu đƣợc đặt trên đá trong 2 phút. Bổ sung 1 ml môi trƣờng LB, lắc hỗn hợp tế bào ở 37C trong 60 phút. Hút

100 ml dịch tế bào cấy trải trên đĩa môi trƣờng LB-ampicillin hoặc LB low salt- zeocin, ủ đĩa ở 37C qua đêm.

2.2.5. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep Miniprep

DNA tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep. Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau:

- Một khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc ni lắc trong 5 ml mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh với tốc độ 200 vòng phút-1

ở 37°C qua đêm. Sinh khối sau khi thu bằng ly tâm đƣợc hòa tan trong 250 µl đệm P1 (resuspension solution). - Một thể tích đệm P2 (lysis solution) đƣợc bổ sung vào dịch tế bào và đảo nhẹ

3 - 5 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. - Hỗn hợp trên đƣợc trung hịa bởi 350 µl đệm P3 (neutralization solution), đảo

đều 4 - 6 lần và ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút. Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với vận tốc 13000 vòng phút-1/ 10 phút/ 4 °C.

- Dịch nổi sau khi ly tâm đƣợc đƣa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10000 vòng phút-1 trong 1 phút. Plasmid đƣợc giữ lại trên lớp màng silica còn dịch qua cột đƣợc gạn bỏ.

- Plasmid đƣợc rửa sạch bằng 500 µl đệm rửa (wash buffer), sau đó gạn bỏ dịch qua cột. Bƣớc này đƣợc lặp lại một lần nữa.

- Cột tinh sạch chứa plasmid đƣợc chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml mới, 100µl đệm đẩy (elution buffer) đƣợc bổ sung vào cột và ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút. Plasmid đƣợc thu bằng cách ly tâm với vận tốc 10000 vòng phút-1 trong 1 phút và bảo quản ở -20°C.

2.2.6. Chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris bằng phương pháp biến nạp xung điện nạp xung điện

Chuẩn bị tế bào:

- Nuôi sơ cấp Pichia pastoris X33: lấy một vịng que cấy tế bào nấm men ni

- Ni thứ cấp: 500 µl dịch ni sơ cấp đƣợc bổ sung vào 100 ml môi trƣờng YPD lỏng 200 rpm/ 28 °C qua đêm.

- Dịch nuôi thứ cấp đƣợc ủ trên đá 10 phút. Sinh khối đƣợc thu bằng cách ly tâm 3000 rpm/ 4 °C/ 5 phút, gạn bỏ dịch. Nƣớc cất 2 lần vô trùng, lạnh đƣợc bổ sung vào mỗi ống sinh khối, tế bào đƣợc hòa tan bằng cách lắc nhẹ nhiều lần.

- Ly tâm, gạn bỏ dịch, thu sinh khối tế bào. Tế bào đƣợc rửa lại bằng nƣớc cất 2 lần đã hấp, lạnh. Sau đó tế bào đƣợc rửa bằng Sorbitol 1M lạnh.

- Ly tâm 3000 rpm/ 4°C/ 5 phút, gạn bỏ dịch, thu sinh khối tế bào. Sorbitol 1M lạnh đƣợc bổ sung vào ống falcon sinh khối, hòa tan tế bào bằng cách lắc nhẹ. Dịch tế bào đƣợc chuyển sang các Eppendorf ủ trên đá cho đến khi biến nạp.

Biến nạp xung điện:

- DNA tinh chế sau khi cắt giới hạn đƣợc bổ sung vào 100 µl dịch tế bào Pichia

pastoris, đảo nhẹ để DNA phân bố đều trong dịch tế bào, chuyển dịch này

sang Cuvette và ủ trên đá 15 phút.

- Cuvette đƣợc đƣa vào máy Micro Pulser (Biorad) đã cài đặt chế độ biến nạp

Pichia pastoris (2.0 kV, 1 msec) nhấn enter.

- Lập tức bổ sung 1 ml Sorbitol 1M vào Cuvette và chuyển dịch sang ống Falcon 15 ml. Nuôi tĩnh tế bào ở 28 °C trong 1-2 giờ.

- Môi trƣờng YPDS đƣợc bổ sung vào dịch tế bào biến nạp và nuôi lắc 200 rpm/ 28 °C/ 1-2 giờ. Sau đó, tế bào đƣợc cấy chang trên đĩa YPDS (zeocin 100 µg ml-1). Ủ ở 30 °C 3 - 10 ngày. Các tế bào biến nạp thành công sẽ mang gen kháng zeocin có khả năng phát triển tạo khuẩn lạc màu trắng trên đĩa YPDS- zeocin.

2.2.7. Tách chiết DNA tổng số của Pichia pastoris

- Dòng nấm men cần tách chiết DNA đƣợc cấy trên đĩa thạch YPD ở 28 °C trong 2 ngày. Dùng que cấy lấy một lƣợng sinh khối nấm men cho vào ống Eppendorf có chứa 750 µl dung dịch 2×SSC, vortex rồi ủ ở 99 C trong 20

- Sinh khối đƣợc thu bằng cách ly tâm 12000 rpm/ 1 phút/ 10 °C, gạn bỏ dịch, bổ sung thêm 750 µl nƣớc deion để rửa sạch tế bào.

- Dịch tế bào đƣợc bổ sung 100 µl hạt thủy tinh và 100 µl dung dịch Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25: 24: 1). Sau đó sinh khối đƣợc đồng hóa bằng máy phá tế bào Biospec. Hỗn hợp đƣợc ly tâm ở 12000 rpm trong 10 phút. Dịch chứa DNA phía trên đƣợc dùng trực tiếp làm khn cho PCR [50].

2.2.8. Phương pháp nuôi biểu hiện nấm men Pichia pastoris

Nuôi biểu hiện Pichia pastoris trên vi đĩa 24 giếng

Một khuẩn lạc nấm men Pichia pastoris đã biến nạp đƣợc cấy vào 1 ml môi

trƣờng BMGY trong giếng của vi đĩa, nuôi lắc ở 28 °C với tốc độ 125 rpm trong 48 giờ. Sau 48 giờ tăng sinh khối, mỗi giếng đƣợc bổ sung 0,1 ml dung dịch methanol 5%. Dịch tế bào đƣợc tiếp tục nuôi lắc ở 28 °C với tốc độ 125 rpm. Sau mỗi 24 giờ, 0,1 ml dung dịch methanol 5% đƣợc bổ sung vào dịch nuôi cấy để nồng độ methanol trong môi trƣờng đạt 0,5%. Sau 96 giờ, dịch nuôi biểu hiện đƣợc ly tâm ở 13000 rpm/ 5 phút/ 10 °C để thu enzyme. Enzyme sau khi thu nhận đƣợc phân tích hoạt tính để tìm ra những thể biến nạp sinh enzyme phytase có hoạt tính cao.

Ni biểu hiện Pichia pastoris trong bình tam giác 1 lít

Một khuẩn lạc nấm men Pichia pastoris đã biến nạp đƣợc cấy hoạt hóa trong 25 ml mơi trƣờng YPD. Sau 36 giờ, dịch nuôi cấy đƣợc chuyển sang 225 ml môi trƣờng BMGY trong bình tam giác 1 lít, ni lắc ở 28 °C với tốc độ 125 rpm trong 24 giờ. Sau khi tăng sinh khối, mỗi 24 giờ, 2,5 ml dung dịch methanol 100% đƣợc bổ sung vào môi trƣờng để biểu hiện sinh tổng hợp enzyme tái tổ hợp. Sau mỗi 96 giờ biểu hiện, dịch nuôi đƣợc ly tâm ở 13000 rpm/ 5 phút/ 10 °C để thu enzyme. Enzyme sau khi thu nhận đƣợc phân tích hoạt tính và nghiên cứu các đặc tính.

2.2.9. Phương pháp điện di protein SDS - PAGE

Chuẩn bị mẫu: Enzyme đƣợc trộn với protein loading dye (Glycerol 20%, SDS

4%, Brommophenol blue 0,2%, β-mercaptoethanol 0,5 ml, Tris – HCl 1,5M pH 6,8 1 ml, định mức lên 10 ml bằng nƣớc cất) theo tỷ lệ 4: 1. Protein đƣợc biến tính trong vịng 5 phút ở 100 °C.

Gel polyacrylamide có SDS bao gồm hai lớp: lớp gel tách có nồng độ 12%, lớp gel cơ có nồng độ 5%, với tỉ lệ các thành phần nhƣ Bảng 2.3.

Bảng 2.3. Thành phần gel chạy điện di protein

Chuẩn bị gel: Sau khi lắp kính,đổ lớp gel tách đến vị trí dƣới chân lƣợcrồi cho

ngay 1 lớp nƣớc cất lên bề mặt. Chờ 30 phút để lớp gel này đông, đổ tiếp lớp gel cô, cài lƣợc, chờ 30 phút để gel đông. Đặt bản gel vào buồng điện di, đổ dung dịch điện giải (Tris base 0,3%; Glycine 1,44%; SDS 0,1%) đến mép bể điện di, gỡ lƣợc, loại bỏ các mẩu gel thừa bên trên giếng nhằm tạo cho giếng sạch để nạp mẫu dễ dàng.

Chạy mẫu: Mẫu đã chuẩn bị ở trên đƣợc nạp vào giếng với thể tích 15 μl mẫu.

Chạy 90V trong khoảng 20 phút sau đó chạy 120V cho đến khi mẫu cách mép dƣới của gel cịn 0,5 cm thì dừng.

Tiến hành nhuộm gel:

- Nhuộm gel trong 50 ml Coomassie brilliant blue (0,1 g Coomassie brilliant blue, 10 ml axit acetic, 45 ml Methanol, 45 ml nƣớc cất) trong 1 giờ hoặc lâu hơn để Coomassie brilliant blue bắt màu với protein.

- Tẩy màu bằng dung dịch tẩy I (140 ml axit acetic, 800 ml Methanol, 1060ml nƣớc cất) trong 30 phút kèm theo lắc, lặp lại 2 lần mỗi lần 50 ml.

- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch tẩy II (140 ml axit acetic, 100 ml methanol, 1760 ml nƣớc cất), kèm theo lắc tới khi thấy rõ các vạch protein.

2.2.10. Xác định hoạt tính phytase

Hoạt tính phytase đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Shimizu và CS, đề xuất năm 1992 [54]. Lƣợng Pvc giải phóng dƣới tác động của phytase đƣợc xác định bằng

Hóa chất Gel tách 12% Gel cô 5 %

Nƣớc cất 2,5 ml 1,385 ml 30% Acrylamide 3 ml 0,415 ml 1.5M Tris-HCl 1.9 ml (pH 8,8) 0,620 ml (pH 6,8) 10% SDS 80 µl 25 µl 30% APS 15 µl 7,5 µl TEMED 15 µl 7,5 µl

dung dịch thử màu chứa 4 lần thể tích dung dịch A (1,5% amoniummolypdate- (NH4)6Mo7O24 + 5,5% H2SO4) và 1 lần thể tích dung dịch B (2,7% FeSO4.7H2O ). Dung dịch thử mầu đƣợc pha và sử dụng trong ngày.

Phản ứng enzyme

Mẫu thí nghiệm: 0,2 ml dịch enzyme + 0,2 ml dịch cơ chất (3 mM Na-phytate trong đệm 0,1 M Na - acetate pH 5,5) ủ 50 C trong 20 phút, sau đó bổ sung 0,4 ml dung dịch 15% TCA (trichloroacetic acid) để dừng phản ứng, tiếp theo bổ sung 0,8 ml thuốc thử, để phản ứng màu bền sau 5 phút rồi xác định OD ở bƣớc sóng 700nm.

Mẫu đối chứng: Thực hiện nhƣ mẫu thí nghiệm nhƣng bổ sung TCA 15% trƣớc khi bổ sung cơ chất.

Xác định đồ thị chuẩn phospho

Dung dịch KH2PO4 đƣợc sử dụng làm chuẩn phospho. Cân chính xác 1,36 g KH2PO4 hồ tan vào 100 ml nƣớc cất thu đƣợc dung dịch 100 mM KH2PO4, từ dung dịch gốc này ta pha loãng thành các nồng độ: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2 mM. Từ mỗi độ pha loãng này lấy ra 0,4 ml để thử phản ứng màu bằng cách bổ sung 0,4 ml TCA, ủ 20 phút ở 50oC rồi bổ sung 0,8 ml thuốc thử màu và xác định OD700nm (Bảng 2.4).

Bảng 2.4. Tƣơng quan giữa hàm lƣợng phospho vô cơ và OD700nm

Nồng độ KH2PO4 (mM) Thể tích mẫu lấy đi thử (ml) Lƣợng Pvc trong mẫu thử (µmol) OD700nm 0,0 0,4 0,0 0,000 0,5 0,4 0,2 0,352 1,0 0,4 0,4 0,680 1,5 0,4 0,6 0,894 2,0 0,4 0,8 1,157

Từ giá trị OD700nm và hàm lƣợng phospho trong dung dịch, phƣơng trình hồi qui tuyến tính (hàm tƣơng quan) đã đƣợc thiết lập. Các hệ số của phƣơng trình hồi qui và hệ số tƣơng quan đƣợc xác định nhƣ sau: Phƣơng trình y = ax + b

Trong đó: y: Hàm lƣợng phospho (µmol) x: Độ hấp phụ của mẫu

n: Hệ số tỉ lệ thuận của y và x

b: Hệ số góc của đƣờng thẳng y = ax + b

Một đơn vị hoạt tính phytase (IU hoặc FTU) đƣợc quy định là lƣợng enzyme cần thiết để giải phóng 1 μmol Pvc trong 1 phút ở điều kiện thử trên.

2.2.11. Lọc enzyme bằng thiết bị Viva Flow 200

Phytase từ A. niger sơ bộ xác định có trọng lƣợng phân tử khoảng 45 kDa, vì thế dùng thiết bị lọc luân hồi Viva Flow 200 với kích thƣớc màng 5 kDa thì những phân tử có kích thƣớc lớn hơn 5 kDa sẽ đƣợc giữ lại trong màng. Còn các phần tử có kích thƣớc nhỏ hơn 5 kDa nhƣ các phân tử muối, đƣờng, chất màu, cặn nhỏ sẽ chui qua lỗ màng đi ra cùng với dịch thải. Quá trình đƣợc tiến hành nhƣ sau: Lắp ráp thiết bị, rửa màng lọc, cho dịch enzyme gốc ở 4 °C chảy luân hồi qua màng nhờ bơm lƣu lƣợng nhỏ. Tốc độ lọc khoảng 100 ml giờ-1. Để giảm nồng độ muối trong dịch enzyme khi dịch cơ đạt thể tích nhỏ khoảng 1/10 thể tích ban đầu bổ sung đệm Na - acetate 0.1 M pH 5.5 và tiếp tục lọc. Sau khi dịch đƣợc cô đến thể tích mong muốn