X33.P12.7: Chủng nấm men Pichia pastoris mang gen gốc, X33.AAS5.2: Chủng nấm men Pichia pastoris mang gen đã cải biến. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với 5 lần lặp lại.
3.4.2. Kiểm tra độ bền với các dải pH của phytase tái tổ hợp
Để kiểm tra khả năng bền pH của phytase tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành ủ các mẫu enzyme ở 37 °C/ 30 phút trong dải pH 1 (đệm KCl – HCl 0,1M), 2 - 3 (đệm glycine – HCl 0,1M), 4 - 6 (đệm Na-citrate 0,1M), 7 – 9 (đệm Tris – HCl 0,1M), 10 (đệm glycine – NaOH 0,1M), sau đó đƣợc pha lỗng trong đệm Na – acetate 50mM pH 5,0 và kiểm tra hoạt tính theo phƣơng pháp Shimizu. Mẫu đối chứng là enzyme pha loãng trong đệm Na – acetate 50mM pH 5,0. Hoạt tính cịn lại đƣợc tính theo hoạt tính của mẫu đối chứng. Mỗi mẫu đƣợc lặp lại 4 lần. Kết quả đƣợc thể hiện trên Hình 3.13 cho thấy, chủng mang gen phyA cải biến vẫn duy trì
đƣợc khả năng bền pH axit. Cả hai chủng đều hoạt động tốt ở pH 3,0 và hoạt tính cịn trên 65% ở điều kiện pH 2,0. Kết quả này chỉ ra rằng chủng X33.AAS5.2 đã cải biến của chúng tơi có thể sinh phytase hoạt động đƣợc trong điều kiện pH thấp của dạ dày. Sự khác biệt giữa chủng cải biến và chủng gốc là khoảng bền pH của phytase cải biến từ 3,0 – 6,0 hẹp hơn chủng gốc từ 3,0 – 7,0, ở pH 7,0 chủng cải
biến giảm hoạt tính mạnh chỉ cịn 30% trong khi chủng gốc vẫn giữ đƣợc 95%. Tuy nhiên, sự khác biệt này khơng đáng kể bởi vì enzyme phytase hoạt động mạnh ở pha tiêu hóa dạ dày có pH thấp để giải phóng phospho và đƣợc hấp thu khi thức ăn chuyển sang pha ruột non có pH kiềm.
Hình 3.13. Đánh giá độ bền pH của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin.
Độ bền pH đƣợc thể hiện bằng hoạt tính cịn lại khi xử lý ở các pH khác nhau trong 30 phút. X33.P12.7: Chủng nấm men Pichia pastoris mang gen gốc, X33.AAS5.2: Chủng nấm men Pichia pastoris mang gen đã cải biến. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với 4 lần lặp lại.
3.4.3. Xác định nhiệt độ tối ưu của phytase tái tổ hợp
Để xác định nhiệt độ tối ƣu của phytase tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành phản ứng enzyme với cơ chất Na-Phytate 3mM ở các nhiệt độ khác nhau: 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90°C trong 20 phút. Kết quả kiểm tra hoạt tính cho thấy, cả hai enzyme tái tổ hợp hoạt động tăng dần từ 30-60°C, hoạt tính cao nhất đạt ở 60°C, chủng gốc X33.P12.7 đạt 107% so với hoạt tính ở 50°C cịn chủng cải biến X33.AAS5.2 đạt 112% (Hình 3.14). Kết quả này đƣợc giả thích nhƣ sau, sự tăng nhiệt độ làm cho động năng của enzyme và cơ chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn dẫn đến các phức chất enzyme-cơ chất hình thành nhiều hơn, phản ứng xảy ra nhanh hơn. Khi nhiệt độ tăng lên từ 70-90°C, hai enzyme hoạt động kém chỉ duy trì từ 5-25% hoạt
tính so với 60°C. Bởi vì nhiệt độ cao làm thay đổi cấu hình vị trí xúc tác, cơ chất không tƣơng tác đƣợc với enzyme dẫn đến hoạt tính của enzyme giảm. Nhƣ vậy, nhiệt độ tối ƣu của cả hai enzyme phytase tái tổ hợp đều là 60°C, sự thay đổi 4 axit amin trong trình tự protein của enzyme gốc khơng ảnh hƣởng tới đặc tính về nhiệt độ của phytase.
Hình 3.14. Xác định nhiệt độ tối ƣu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit
amin.X33.P12.7: Chủng nấm men Pichia pastoris mang gen gốc, X33.AAS5.2: Chủng nấm men Pichia pastoris mang gen đã cải biến. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với 5 lần lặp lại.
3.4.4. Kiểm tra khả năng hồi tính của phytase tái tổ hợp sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao nhiệt độ cao
Để kiểm tra khả năng hồi tính của phytase tái tổ hợp, chúng tơi tiến hành ủ các mẫu enzyme ở nhiệt độ 60, 70, 80, 90 và 100 °C trong 20 phút và sau đó giữ ở 4°C trong vịng 24 giờ. Mẫu đối chứng là enzyme giữ trong tủ lạnh 4C. Hoạt tính của các mẫu enzyme phytase này đƣợc kiểm tra theo phƣơng pháp Shimizu. Hoạt tính cịn lại đƣợc tính theo hoạt tính của mẫu đối chứng. Mỗi mẫu đƣợc lặp lại 4 lần. Kết quả kiểm tra hoạt tính cho thấy, từ 60 °C cả hai enzyme tái tổ hợp đều mất dần hoạt tính, tuy nhiên phytase sau khi cải biến có khả năng hồi tính cao hơn so với
enzyme gốc (Hình 3.15). Ở 90C enzyme cải biến giữ đƣợc 64% hoạt tính, trong khi đó giá trị này của enzyme gốc (P12) là 47% cao hơn 17%. Nghiên cứu của tác giả Zhang và cộng sự mà chúng tôi tham khảo cũng thu đƣợc kết quả nhƣ trên, enzyme cải biến của họ có hoạt tính cao hơn chủng gốc 20% sau khi biến tính ở 90°C và 100°C [73].
Hình 3.15. Đánh giá độ bền nhiệt của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin. Độ bền nhiệt đƣợc thể hiện bằng hoạt tính cịn lại khi xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau trong 20 phút. X33.P12.7: Chủng nấm men Pichia pastoris mang gen gốc, X33.AAS5.2: Chủng nấm men Pichia pastoris mang gen đã cải biến. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với 4 lần lặp lại.
Năm 2012, Edward Mullaney và CS cũng có nghiên cứu về ảnh hƣởng của các liên kết disulfide trong phân tử phytase từ nấm mốc A. niger NRRL 3135 bằng đột biến điểm [39]. Tác giả tạo 4 chủng mang 4 đột biến lần lƣợt là C31G, C40G, C31G/C40G, C31G/C40S, kết quả kiểm tra độ bền nhiệt của phytase từ 4 chủng này cho thấy sau khi xử lý nhiệt ở 70 °C chủng mang đột biến C31G/C40S cịn giữ đƣợc hoạt tính gần nhƣ ban đầu ở 37 °C và 42 °C, chủng mang đột biến C31G, C40G, C31G/C40G giữ đƣợc hoạt tính thấp hơn khoảng 15 – 50 % cịn chủng gốc thì chỉ giữ đƣợc 20% hoạt tính ở 37 °C. Trong đó, chỉ có chủng mang đột biến C40G cịn
15% hoạt tính ở 52 °C. So sánh với kết quả mà chúng tôi thu đƣợc, sau khi xử lý nhiệt 70 °C hoạt tính phytase ở 50 °C còn khá cao, chủng gốc khoảng 60% trong khi chủng cải biến khoảng 75 %. Nhƣ vậy, hƣớng nghiên cứu cải biến gen bằng đột biến điểm mà chúng tôi lựa chọn là hƣớng đi hợp lý.
Từ tất cả các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi khẳng định đã tạo đƣợc chủng X33.AAS5.2 (P. pastoris CNTP 9057) mang gen phyA đã cải biến sinh tổng hợp phytase hoạt tính cao hoạt động ở pH thấp, phù hợp với môi trƣờng axit của dịch dạ dày, có khả năng hồi tính sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao, phù hợp để xử lý ở 80 C trong quá trình ép viên. Đây là hai yêu cầu quan trọng nhất để ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi.
KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Bằng kỹ thuật Mega-PCR đã tạo đƣợc 4 đột biến điểm dẫn đến thay thế 4 axit amin alanin, proline, glutamine, threonine lần lƣợt ở vị trí 58, 65, 191, 217 bởi glutamic, serine, arginine và arginine.
2. Đã chuyển đƣợc gen phyA gốc và phyA mang 4 đột biến điểm vào Pichia pastoris X33 để tạo các chủng CNTP 9056 và CNTP 9057 sinh enzyme phytase gốc và phytase cải biến với hoạt tính cao.
3. Đã thu hồi và tinh sạch enzyme gốc và enzyme cải biến bằng phƣơng pháp siêu lọc kết hợp với sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc.
4. Đã khảo sát nhiệt độ, pH tối ƣu, độ bền nhiệt, độ bền pH của enzyme gốc và enzyme cải biến. Kết quả cho thấy sự tƣơng đồng cao về đặc tính hoạt động của 2 enzyme, tuy nhiên enzyme cải biến đƣợc cải thiện rõ rệt về tính bền nhiệt.
KIẾN NGHỊ
Để hƣớng tới mục tiêu sản xuất phytase phục vụ ứng dụng trong chăn nuôi, chúng tôi đƣa ra một số kiến nghị sau:
1. Tiếp tục nâng cao khả năng biểu hiện phytase của chủng tái tổ hợp thông qua việc tạo chủng Pichia pastoris mang nhiều cassette biểu hiện gen phyA.
2. Cần xây dựng quy trình tạo chế phẩm phytase dạng bột khô nhằm đáp ứng nhu cầu sản xuất thức ăn chăn nuôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Nguyễn Thùy Châu, (2009), “Hồn thiện cơng nghệ sản xuất enzym phytaza để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp”, Báo cáo
dự án khoa học kỹ thuật-Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Viện Cơ
điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch.
2. Vũ Duy Giảng, (2004), “Enzyme thức ăn”, Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, 3, tr. 11-13.
3. Đỗ Thị Ngọc Huyền, (2007), Nghiên cứu tính chất phytase tự nhiên và tái tổ hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam
4. Đỗ Hữu Phƣơng, (2004), “Vai trị của enzyme trong chăn ni”. Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, 1, tr. 25-26.
5. Nguyễn Văn Viết, (2008), Nghiên cứu biểu hiện gene phyC có nguồn gốc từ Bacillus subtilis trên E. coli BL21 (DE3) và bước đầu ứng dụng enzyme tái tổ
hợp cho chăn nuôi, Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, Trƣờng đại học Sƣ phạm Hà nội.
6. Ngô Thanh Xuân, Mai Thị Hằng, Nguyễn Phƣơng Linh, Đinh Thị Mỹ Hằng, Vũ Nguyên Thành, (2012), “Phân tích trình tự gene (phyA) mã hóa phytase thành thục từ một số chủng Aspergillus niger”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học,
10(1), tr. 115-122.
Tiếng anh
7. Anderson R. J., (1914), “A contribution to the chemistry of phytin”, J. Biol. Chem., 17, pp. 171 –190.
8. Anno T., Nakanishi K., Matsuno R., Kamikubo T., (1985), “Enzymatic elimination of phytate in soybean milk”, J. Japan Soc. Food Sci. Techno.l, 32,
pp. 174-180.
9. Baruah K., Pal A. K., Sahu N. P., Jain K. K., Mukherjee S. C., Debnath D., (2005), “Dietary protein level, microbial phytase, citric acid and their
interactions on bone mineralization of Labeo rohita (Hamilton) juveniles”,
Aquacult. Res., 2005, 36, pp. 803–812.
10. Baruah K., Sahu N. P., Pal A. K., Debnath D., Yengkokpam S., Mukherjee S. C., (2007), “Interactions of dietary microbial phytase, citric acid and crude protein level on mineral utilization by Rohu, Labeo rohita (Hamilton), juveniles”, J. W. Aquacult. Soc., 38, pp. 238–249.
11. Billington D. C., (1993), “The Inositol Phosphates. Chemical Synthesis and Biological Significance”, Verlag. Chemie. Weinheim., 26, pp. 38-42.
12. Cheng C., Lim B. L., Turner B. L., Richardson A. E., Mullaney E. J., (2005), “Beta-propeller phytases in the aquatic environment: characterization of a novel phytase from Shewanella oneidensis MR-1. In Inositol Phosphates in the Soil-Plant-Animal System: Linking Agriculture and Environment”.
Proceedings of the Bouyoucos Conference to Address the Biogeochemical Interaction of Inositol Phosphates in the Environment; USA, pp. 55–56.
13. Copper J. R., Gowing H. S., (1983), “Mammalian small intestine phytase”, Br. J. Nutr., 50, pp. 673-678.
14. Correa R. L. T., Queiroz V. M., Araujo F. E., (2014), “Cloning, recombinant expression and characterization of a new phytase from Penicillium chrysogenum”, Microbiol. Res., pp. 201-213
15. Craxton A., Caffrey J. J., Burkhart W., Safrany S. T., Shears S. B., (1997) “Molecular cloning and expression of a rat hepatic multiple inositol polyphosphate phosphatase”, Biochem. J., 328, pp. 75-81.
16. Dalal R. C., (1978), “Soil organic phosphorus”, Adv. Agronom., 29, pp. 83– 117.
17. Davies N. T., Vahoung G. V. and Kritchevsky D., (1982), “Effects of phytic acid on mineral availability”, In Dietary Fiber in Health and Disease, Eds.
Plenum Press, New York, pp. 125-138.
18. Dawei F., Huoquing H., Huiying L., Yaru W., Peilong Y., Kun M., (2008), “A highly pH-stable phytase from Yersinia kristeensenii: Cloning, expression, and characterization”, Enz. Microbiol. Tech., 42, pp. 499-505.
19. Debnath D., Pal A. K., Sahu N. P., Jain K. K., Yengkokpam S., Mukherjee S. C, (2005), “Effect of dietary microbial phytase supplementation on growth and nutrient digestibility of Pangasius pangasius (Hamilton) fingerlings”,
Aquacult. Res., 36, pp. 180–187.
20. Deshpande S. S., Cheryan M., (1984), “Effect of phytic acid, divalent cations, and their interactions on alpha-amylase activity”, J. F. Sci., 49, pp. 516-524. 21. Ellestad L. E., Angel R., Soares J. H., (2002), “Intestinal phytase II: A
comparison of activity and in vivo phytate hydrolysis in three teleost species with differing digestive strategies”, Fish. Physiol. Biochem., 26, pp. 259–273. 22. Findenegg G. R., Nelemans J. A., (1993), “The effect of phytase on the
vailability of P from myo-inositol hexaphosphate (phytate) for maize roots”, Plant Soil, 154, pp. 189-196.
23. Forsberg C. W., Phillips J. P., Golovan S. P., Fan M. Z., Meidinger R. G., Ajakaiye A., Hilborn D., Hacker R. R., (2003), “The enviropig physiology, performance, and contribution to nutrient management advances in a regulated environment: the leading edge of change in the pork industry”, J. Anim. Sci.,
81, pp. 68–77.
24. Freund W. D., Mayr G. W., Tietz C., Schultz J. E., (1992), “Metabolism of inositol phosphates in the protozoan Paramecium”, Eur. J. Biochem., 207, pp. 359-367.
25. Greaves M. P., Anderson G., Webley D. M., (1967), “The hydrolysis of inositol phosphates by Aerobacter aerogenes”, Biochem. Biophys. Acta., 132, pp. 412- 418.
26. Greiner R. and Konietzny U., (1996), “Construction of bioreactor to produce special breakdown products of phytate”, J. Biotechnol., 1996, 48, pp. 153-159. 27. Hartig, T., (1885), “Uber das Klebermehl”, Bot. Z., 13, 881–882
28. Hartig T., Weitere M., (1856), “das Klebermehl (Aleuron) betreffend”, Bot. Z., 14, 257 –269
29. Hegeman C. E. and Grabau E. A., (2001), “A novel phytase with sequence similarity to purple acid phosphatases is expressed in cotyledons of germinating soybean seedlings”, Plant Physiol., 126, pp. 1598–1608.
30. Hesampour A., Siadat S. E. R., Malboobi M. A., Mohandesi N., Arab S. S., Ghahremanpour M. M., (2014), “Enhancement of thermostability and kinetic efficiency of Aspergillus niger phyA phytase by site direct mutagenesis”, Appl. Biochem. Biotechnol., pp. 67-81.
31. Howson S. J., and Davis R. J., (1983), “Production of phytate-hydrolysing enzyme by fungi”. Enzyme Microbiol. Technol., 5, pp. 377-382.
32. Inagawa J., Kiyosawa I., Nagasawa T., (1987), “Effect of phytic acid on the hydrolysis of lactose with beta-galactosidase”, Agric. Biol. Chem., 51, pp.
3027-3032.
33. Irving G. C. J., Cosgrove D. J., (1971), “Inositol phosphate phosphatase of microbial origin, Observations on the nature of the active center of a bacterial (Pseudomonas sp.) phytase”, Austral. J. Biol. Sci., 24, pp. 1559-1564.
34. Jog S. P., Garchow B. G., Mehta B. D., Murthy P. P. N., (2005), “Alkaline phytase from lily pollen: Investigation of biochemical properties”, Arch. Biochem. Biophys., 440, pp. 133–140.
35. Laboure A. M., Gagnon J., Lescure A. M., (1993), “Purification and characterization of a phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase) accumulated in maize (Zea mays) seedlings during
germination”, Biochem. J., 295, pp. 413-419.
36. Li Z., Zhao A., Wang X., Jin X., Li J., Yu M., (2013), “Cloning, expression, and functional characterization of a phytase from the genus Bacillus”, J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 23, pp.193-202.
37. Liu B. L., Rafiq A., Tzeng Y. M. and Rob A., (1998), “The induction and characterization of phytase and beyond”. Enzyme Microbiol. Technol., 22, pp.
38. Mrudula V. U., Jalaja V., Ashok P., (2014), “Gene cloning and soluble expression of Aspergillus niger phytase in E. coli cytosol via chaperone co- expression”, Biotechnol. Lett., 36, pp. 85-91.
39. Mullaney E., Sethumadhavan K., Stephanie B., Lei X. G., Ullah A. H. J., (2012), “Elimination of disulfide bridges in Aspergillus niger NRRl 3135 phytase (phyA) enhances heat tolerance and optimizes its temperature versus activity profile”, Ad. Bio. Chem., 2, pp. 372 – 378.
40. Ngo Thanh Xuan, Mai Thi Hang and Vu Nguyen Thanh, (2009), “Cloning and over expression of an Aspergillus niger XP phytase gene (phyA) in Pichia pastoris”, World Academy of Science, Engineering and Technology, 56, pp.
750 – 753.
41. Nwanna L. C., Schwarz F. J., (2007), “Effect of supplemental phytase on growth, phosphorus digestibility and bone mineralization of common carp (Cyprinus carpio L)”, Aquacult. Res., 38, pp. 1037–1044.
42. Pandey A., Szakacs G., Soccol C. R., Rodriguez-Leon J. A., Soccol V. T., (2001), “Production, purification and properties of microbial phytases”,
Bioresour. Technol., 77, pp. 203-214.
43. Phillippy B. Q., Wyatt C. J., (2001), “Degradation of phytate in foods by phytases in fruits and vegetable extracts”, J. F. Sci., 66, pp. 535–539.
44. Phillippy, B. Q., Bland, J. M., Evens, T. J., (2003), “Ion chromatography of phytate in roots and tubers”, J. Agric. F. Chem., 51, 350–353
45. Raboy V., (2003), “myo-Inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphates”,
Phytochemistry, 64, 1033–1043
46. Rao D. E., Rao K. V., Reddy T. P., Reddy V. D., (2009), “Molecular characterization, physicochemical properties, known and potential applications of phytases: An overview”, Crit. Rev. Biotechnol., 29(2), pp. 182-98.
47. Reddy N. R., Pierson M. D., Sathe S. K., Salunkhe D. K., (1989), “Phytates are cereals and legumes”, CRC Press. Inc. Boca Raton. Fla, pp. 218-227.
48. Rimbach G., Pallauf J., (1992), “The effect of a supplement of microbial phytase on zinc availability”, Z. Ernahrungswiss, 31, pp. 269-277.