Địa điểm nghiên cứu

CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI IỆU

2.1. Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu này được thực hiện trên năm mặt cắt khác nhau của lưu vực sông Nhuệ - Đáy với 42 điểm lấy mẫu (24 điểm lấy mẫu trên sông và 18 điểm ở các ao nuôi trồng thủy sản). Mẫu được thu thập trong bốn mùa, mùa thu, mùa đông, mùa xn và mùa hạ, tương ứng (hình 2.1).

• Mặt cắt 1: Thượng nguồn sơng Nhuệ nơi ít bị ảnh hưởng bởi nước thải từ Hà Nội, tiến hành thu 3 điểm từ sơng Hồng (đối chứng).

• Mặt cắt 2: Trên sông Nhuệ, khu vực đập Thanh Liệt (Hà Nội), nơi sông Tô Lịch chảy vào sông Nhuệ, tiến hành thu 3 mẫu trên sông Nhuệ, trước khi hợp lưu với sông Tô Lịch (Cầu Đen - Hà Đông), 3 mẫu sau khi hợp lưu với sông Tô Lịch, 3 mẫu ao nuôi cá sử dụng nước từ sơng Nhuệ ở Thanh Trì, Hà Nội; và 3 mẫu từ các ao nuôi cá ở huyện Chương Mỹ, Hà Nội.

• Mặt cắt 3: Tại ngã ba sơng Nhuệ, sông Đáy và sông Châu Giang ở Phủ Lý. Thu thập 3 mẫu từ sông Đáy, 3 mẫu từ sông Nhuệ, 3 mẫu từ các ao nuôi trồng thủy sản sử dụng nước sông Nhuệ (Duy Tiên) và 3 mẫu từ các ao nuôi trồng thủy sản sử dụng nước từ sơng Đáy (Thanh Liêm).

• Mặt cắt 4: Trên sơng Đáy, nơi hợp lưu của sơng Hồng Long và sơng Đáy (Ninh Bình). Thu 3 mẫu từ sông Đáy và 3 mẫu từ các ao nuôi trồng thủy sản ở Ninh Giang (Ninh Bình).

• Mặt cắt 5: Trên sông Đáy, dưới hợp lưu với sông Đào (Nghĩa Hưng), trong đó chủ yếu là nguồn nước từ sông Đào. Thu thập 3 mẫu từ sông Đáy và 3 mẫu từ các ao nuôi cá sử dụng nước từ sơng Đáy.

Hình 2. 1: Sơ đồ vùng nghiên cứu và vị trí thu mẫu trong lƣu vực sơng Nhuệ - Đáy (Nguồn: Đề cƣơng dự án Nhuệ - Đáy – Ngô Thị Thúy Hƣờng, 2011)

2.2. Phƣơng pháp thu mẫu

Mẫu cá (cá chép và cá rơ phi thu ở sơng và ao tại vị trí thu mẫu được xác định trên hình 2.1) được thu thập trong bốn mùa của năm (bắt đầu vào mùa thu năm 2012 và kết thúc vào mùa hè năm 2013). Trong mỗi mùa, bắt cá (đánh lưới) tại các ao nuôi sử dụng nước sông nhuệ và cá đánh bắt ở sông Nhuệ - Đáy được vận chuyển sống trong ngày về phịng thí nghiệm trong các túi chứa nước ao/sơng mà cá sinh sống và được bơm oxy.

Cá mẫu đối chứng được thu từ sông Hồng để so sánh với cá đánh bắt từ lưu vực sông Nhuệ - Đáy.

21

2.3. Chuẩn bị mẫu phân tích

Khi cá được chuyển đến phịng thí nghiệm, các mẫu cá được sắp xếp theo lồi, theo địa điểm thu mẫu, sau đó, gây mê cá với MS222 0.5%, đo các chỉ số kích thước như tổng độ dài (cm) và trọng lượng cơ thể cá (g) của mỗi mẫu vật cá.

Cá được mổ trên khay đá lạnh và lấy các mẫu mang, gan và thận vào các ống eppendorf sạch đã cân bì. Trọng lượng của mỗi mẫu sau đó được cân và điều chỉnh khối lượng cho phù hợp với yêu cầu của từng phân tích. Cụ thể đối với các mẫu dùng cho phân tích kim loại nặng cân khoảng 20 - 100 mg trọng lượng tươi; mẫu dùng cho phân tích protein và GST cân khoảng 5 - 10 mg (gan, thận) hoặc 10 - 20 mg (mang). Trong suốt quá trình mổ và lấy mẫu, cá và mẫu được giữa trên đá lạnh. Mẫu ngay sau khi được lấy xong được giữ lạnh sâu ở nhiệt độ -80°C trong 300 µl dung dịch đệm TBS (protein) và 300 µl DPBS (GST) tới khi phân tích.

2.4. Phân tích mẫu

2.4.1. Phân tích kim loại nặng

Trong nghiên cứu này, căn cứ vào chức năng sinh học, độc tính và mức độ phổ biến mà chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu trên 4 kim loại nặng sau: đồng (Cu), cadmium (Cd), kẽm (Zn) và chì (Pb).

Phân tích dựa trên phương pháp của Gerstmann và Frank và được cải tiến bởi TS. Ngô Thị Thúy Hường (2010). Trong đó, mẫu mơ được chuyển vào ống thuỷ tinh 40 mL đã chuẩn bị trước. Mẫu sau đó được vơ cơ hố bằng hỗn hợp acid HNO3 65% + HCL 30% theo tỉ lệ 4:1 và để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ trước khi H2O2 tinh khiết được cho vào và để yên trong 5 giờ nữa. Sau đó mẫu được xếp vào hộp nhựa chịu nhiệt kín và vơ cơ hố trong lị ở nhiệt độ 120°C trong vòng 5 tiếng tới khi mẫu được vơ cơ hố hồn tồn (trong và khơng có bọt). Mẫu được để nguội ở nhiệt độ phòng trước khi pha loãng với nước cất đến 20 mL và lọc bằng màng lọc xen-lu-lơ 0.45 µm (cellulose filter) gắn với xi lanh 10 mL. Mẫu sau đó sẽ được cất ở 4°C trong vòng 2 tháng hoặc ở -20°C trong vòng 6 tháng đến khi đo nồng đồ kim loại nặng trên máy khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS).

Mỗi tập mẫu phân tích chuẩn bị một mẫu hiệu chuẩn kiểm chứng và 1 mẫu trắng (chỉ chứa hỗn hợp acid HNO3 65% + HCL 30% theo tỉ lệ 4:1) và cũng tiến hành các bước chuẩn bị như mẫu phân tích. Bằng cách đó cho phép chúng ta hiệu đính các sai số bất thường gây ra bởi qua trình vơ cơ hố và đo mẫu.

2.4.2. Phân tích protein

Mẫu được rã đơng trên đá lạnh trước khi đem nghiền bằng máy nghiền mô trên đá lạnh và ly tâm lạnh ở 9205 rpm, 4o

C trong 15 phút. Thu dung dịch nổi vào ống eppendorf mới. Cặn lắng được nghiền trong dung dịch TBS và ly tâm lại thêm một lần nữa để thu càng nhiều enzyme càng tốt. Dung dịch nổi sau đó được giữ lạnh ở 0°C nếu phân tích trong ngày hoặc ở -20°C nếu phân tích trong tuần. Nồng độ protein sẽ được xác định bằng phương pháp Bradford trên đĩa 96 giếng. Tóm tắt quy trình như sau: Hồ tan protein trong 100 µL mẫu đã nghiền và ly tâm ở trên với 900 µL dung dịch 0.01 N NaOH (hệ số pha loãng DF = 10), trộn mẫu đều bằng Vortexer trong khoảng 10 giây. Sau đó sử dụng phương pháp Bradford BSA để xác định protein tổng số. Dung dịch làm việc BSA 250 µg/mL được pha để chuẩn bị dãy chuẩn protein cho mỗi tập mẫu phân tích theo các nồng độ protein trong khoảng 5 - 60 µg protein/mL bằng cách pha lỗng với dung dịch đệm TBS. Chuẩn bị dãy chuẩn song song với q trình thao tác mẫu; Pha lỗng mẫu với dung dịch đệm A để có nồng độ tương đương 5 - 60 µg/ml BSA. Ủ hỗn hợp mẫu pha loãng và dãy chuẩn trong 30 phút ở 60°C trong tủ sấy. Mẫu sau khi để nguội ở nhiệt độ phịng sẽ được phân tích với 3 lần lặp lại trên đĩa 96 giếng. Cụ thể, cho 30 µl dung dịch chuẩn hoặc mẫu vào mỗi giếng, sau đó cho tiếp 150 µl dd Bradford Reagent 3x (pha lỗng 3 lần), lắc trong 30 giây. Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong vòng 5 - 45 phút. Đo độ hấp thụ ánh sáng (mật độ quang) ở bước sóng 595 nm (kính lọc tham chiếu 495 nm). Độ hấp thụ của mẫu phải được ghi lại trước thời hạn 60 phút và trong vịng 10 phút. Vẽ hình mật độ quang theo từng nồng độ tương ứng của mẫu chuẩn. Nồng độ protein được xác định dựa trên đường cong chuẩn và chuẩn hoá cho trọng lượng ướt hoặc khơ của mẫu mơ (µg/g trọng lượng tươi hoặc mg/g trọng lượng tươi).

2.4.3. Phân tích GST

Hoạt tính GST được xác định bằng phương pháp Habig [29]: Mẫu được nghiền và ly tâm ở 4°C, 9.000xg (tương đương 9205 rpm đối với máy ly tâm 5417R Eppendorf) trong 30 phút. Lặp lại quy trình trên hai lần và kết hợp phần dung dịch nổi phía trên (supernatant) thu được từ hai lần ly tâm vào 1 ống

23

định hoạt tính của GST. Dung dịch phản ứng bao gồm hỗn hợp của 100 mM DPBS đệm (pH = 6,5), 200 mM GSH và 100 mM CDNB có nồng độ là 2 mM GSH và 1 mM CDNB. Phản ứng được bắt đầu bằng cách trộn 0,98 hoặc 0,95 ml hỗn hợp phản ứng với 0,02 hoặc 0,05 ml mẫu, tương ứng và độ hấp thụ của từng mẫu được đo 1 phút/ 1 lần trong vòng 7 phút ở 340 nm sử dụng máy đo quang phổ nhiệt Sciencetific TM Biomate. Cứ mỗi tập mẫu đo có một mẫu trắng (có chứa 1 ml dung dịch chất nền). Hoạt tính của enzyme được xác định lặp lại 2 lần và được thể hiện bằng µmol chất nền bị thuỷ phân trong 1 phút, trên 1 mg protein.

Hoạt tính của GST đã được tính tốn dựa trên cơng thức với các hệ số được tính tốn bằng cách sử dụng các yếu tố thay thế 9,6 mM-1cm-1 và cuối cùng tính nmol GSH-CDNB conjugate / phút / mg protein.

2.5. Phân tích và xử lý số liệu

Tất cả dữ liệu đã được trình bày là giá trị trung bình ± SEM. Sử dụng phần mềm GraphPad InStat, sự khác biệt về nồng độ protein, GST và nồng độ kim loại nặng trong từng loại mô, được đánh giá bằng cách phân tích phương sai một nhân tố (ANOVA) và tiếp theo là dùng chương trình so sánh nhiều biến Student- Newman-Keuls để kiểm định sự khác biệt có đáng kể hay khơng. Mức độ ý nghĩa của các phép kiểm định được ấn định bởi dấu hoa thị như sau: * = 0,05 ≥ p ≥ 0,01, ** = 0.01 ≥ p ≥ 0.001, và *** = p ≤0.001.

Mối tương quan giữa các biến (nồng độ kim loại nặng tích lũy và nồng độ protein/GST trong cùng mẫu phân tích) được kiểm định với nonparametric. Kiểm định mức độ tương quan Spearman r (p <0,05). Nếu các biến tương quan có ý nghĩa, thì sau đó nó được phân tích bằng hồi quy đơn giản. Ý nghĩa thống kê được ấn định tại p <0,05.

CHƢƠNG 3:

KẾT QUẢ VÀ THẢO UẬN

3.1. Phân tích và đánh giá nồng độ kim loại nặng tích tụ trong cá

3.1.1. Biến động của sự tích lũy kim loại nặng trong các mơ phân tích theo mùa

Kết quả bảng 3.1 và 3.2 đã cho thấy nồng độ kim loại nặng tích tụ trong các mơ nghiên cứu của cá chép và cá rô phi ở LVS Nhuệ - Đáy khá cao và có biến động theo mùa. Nồng độ Cu, Zn, Pb, Cd trong tất cả các cơ quan (mang, gan, thận) đều cao hơn nhiều so với tiêu chuẩn quốc tế về giới hạn nồng độ kim loại nặng tích tụ trong sản phẩm có thể tiêu thụ (UNEP và WHO). Cụ thể các giới hạn đã được đưa ra như sau: Pb là 0,29 ppm, Zn là 5,0 ppm, Cu là 0,5 ppm và Cd là 0,05 ppm [58, 61]. Ngoài ra, các trường hợp đủ tiêu chuẩn khá ít ỏi và đều là nồng độ Cd trong mang trong ba mùa, mùa thu, mùa đông và mùa xuân ở cả hai lồi cá chép và cá rơ phi (0,009±0,002, 0,004±0,0014, 0,006±0,003 ở cá chép và 0,009±0,002, 0,003±0,0005, 0,004±0,002 ở cá rô phi tương ứng) (bảng 3.1, 3.2).

Ở tất cả các mẫu mơ (mang, gan, thận), Zn có nồng độ cao nhất, theo sau lần lượt là Cu, Pb và thấp nhất là Cd. Zn và Cu đều là các kim loại thiết yếu, trái ngược với Cd và Pb, do đó chúng được tích lũy với nồng độ cao hơn trong ba loại mô của cá chép và cá rô phi. Kết quả là này phù hợp với các điều tra sự tích tụ Zn, Cu, Pb, Cd của các nghiên cứu trước đây ở Esox lucius và Arassius auratus tại

biển Caspian. Trong số các cơ quan nghiên cứu, gan và thận là hai cơ quan có xu hướng tích tụ kim loại nặng nhiều hơn cả (bảng 3.1, 3.2).

Ở cá chép: Trong bốn mùa thu thập mẫu, mùa hè là mùa có sự tích tụ nồng độ kim loại nặng cao hơn hẳn so với ba mùa còn lại. Cụ thể, vào mùa hè, nồng độ Cu trong mang, gan, thận cao hơn các giá trị tương ứng ở ba mùa trước đó; nồng độ Pb tích tụ ở gan cũng đạt giá trị cao nhất so với nồng độ này ở mẫu gan thu vào ba mùa trước đó. Đặc biệt, nồng độ Cd tích tụ trong cả 3 cơ quan với các giá trị cao nhất vào mùa hè. Xu hướng tích tụ: Cu tập trung cao nhất ở gan (mùa đông), Zn ở mang (mùa xuân), Pb ở thận (mùa xuân), Cd ở thận (mùa hè).

25

Bảng 3.1: Nồng độ của đồng, kẽm, cadmium, chì (ppm hay mg/kg) trong các cơ quan khác nhau của cá chép thu thập từ lƣu vực sông Nhuệ - Đáy trong bốn mùa thu mẫu (giá trị trung bình + SEM)

Thu Đông Xuân Hè

Zn (ppm) Mang 151±29,2 200±22,9 227±29,2 183±22,7 Gan 88±15,7 108,9±13,2 140±39,2 111±15,8 Thận 190±40,4 236±35 303±71,5 270±40,5 Cu (ppm) Mang 1,5±0,15 2,1±0,44 1,7±0,2 3,5±0,21 Gan 12±2,6 23,9±5,3 9,8±3,4 18,7±1,9 Thận 4±0,42 5,2±0,87 6,2±1,5 14,1±1,9 Cd (ppm) Mang 0,009±0,002 0,004±0,001 0,006±0,003 0,09±0,009 Gan 0,05±0,03 0,04±0,0098 0,1±0,04 0,14±0,017 Thận 0,16±0,07 0,2±0,05 0,22±0,07 0,5±0,065 Pb (ppm) Mang 0,5±0,09 0,48±0,1 0,73±0,11 0,67±0,11 Gan 0,34±0,09 0,31±0,08 0,36±0,05 0,81±0,06 Thận 0,51±0,13 0,33±0,05 2,3±0,96 1,6±0,24

Ở cá rô phi: Nồng độ kim loại nặng cao nhất cũng chủ yếu tập trung vào mùa hè như ở cá chép, ngoại trừ nồng độ Zn (tích tụ nhiều hơn cả vào mùa đơng, bảng 3.2). Tuy nhiên, những biến đổi đáng kể về nồng độ kim loại nặng tích tụ ở cá rô phi bắt đầu sớm hơn cá chép, từ đầu mùa đông, nồng độ của đa số kim loại nặng đã tăng rất đáng kể. Có thể thấy, nồng độ kim loại nặng tích tụ vào mùa thu thấp hơn hẳn so với ba mùa cịn lại (bảng 3.2). Trong đó: Cu tập trung cao nhất ở gan tương tự như kết quả ở cá chép nhưng không phải vào mùa đông mà vào mùa xuân, Cd tập trung cao nhất ở thận (mùa hè), tương tự như ở cá chép; còn hai kim loại Zn và Pb, Zn cao nhất ở thận (mùa đông), Pb ở thận (mùa hè).

* So sánh sự tích tụ KLN giữa 2 lồi cá theo mùa: Có hai sự khác nhau rõ rệt về nồng độ kim loại nặng tích tụ giữa cá chép và cá rô phi. Trước tiên, phải kể đến nồng độ Zn rất cao ở mang, gan, thận cá chép so với cá rô phi. Thứ hai, khi xem xét nồng độ Cu tích tụ tại gan của hai loài cá nghiên cứu, Cu trong gan cá rơ phi có xu hướng tích tụ cao hơn rất nhiều so với nồng độ này trong các mô khác (bảng 3.1, 3.2).

Bảng 3.2: Nồng độ của đồng, kẽm, cadmium, chì (mg/kg) trong các cơ quan khác nhau của cá rô phi thu thập từ lƣu vực sông Nhuệ - Đáy trong bốn mùa lấy mẫu (giá trị trung

bình + SEM)

Thu Đông Xuân Hè

Zn (ppm) Mang 27,2±2,3 52±11,4 30,3±4,4 28,2±1,6 Gan 31,6±2,8 58,5±13,6 33,6±4,5 41,5±4,7 Thận 76,8±22,9 107±21,3 45,2±4,3 97,7±27,5 Cu (ppm) Mang 1,7±0,29 2,4±0,51 2,2±0,18 4,1±0,56 Gan 79,7±17,8 101±10,2 191±36,8 100±13,4 Thận 9±2,9 6,5±0,98 5±0,55 15,7±3,3 Cd (ppm) Mang 0,009±0,002 0,003±0,0005 0,004±0,002 0,07±0,007 Gan 0,09±0,017 0,17±0,03 0,242±0,06 0,28±0,04 Thận 0,28±0,08 0,27±0,07 0,35±0,07 0,55±0,16 Pb (ppm) Mang 0,61±0,08 0,38±0,08 0,81±0,18 0,77±0,15 Gan 0,52±0,1 0,63±0,14 0,87±0,14 1,6±0,27 Thận 1,2±0,28 0,72±0,16 1,2±0,28 1,9±0,44

3.1.2. Sự tích lũy kim loại nặng trong các mơ phân tích theo mặt cắt

Bảng 3.3 và 3.4 đã cho thấy một kết quả tương tự như khi xét sự tích lũy kim loại nặng trong các mơ phân tích trong 4 mùa, hầu hết nồng độ Cu, Zn, Pb, Cd trong tất cả các cơ quan (mang, gan, thận) đều cao hơn nhiều so với tiêu chuẩn quốc tế về giới hạn nồng độ kim loại nặng tích tụ trong sản phẩm có thể tiêu thụ (theo UNEP và WHO). Trừ các trường hợp đủ tiêu chuẩn như: Ở cá chép, Cd trong mang ở mặt cắt 2, 3, 5 (0,030±0,034, 0,0415±0,054 và 0,033±0,043 tương ứng), trong gan ở mặt cắt 2 (0,039±0,035) (bảng 3.3). Ở cá rơ phi, chỉ có nồng độ Cd trong mang cả bốn mặt cắt là không quá giới hạn cho phép (bảng 3.4).

Ở mặt cắt 1, trên sơng Hồng số liệu thu được ít (2 mẫu cá chép, 1 mẫu cá rô phi, tổng các mẫu đối chứng là 9 mẫu cả mang, gan và thận) nên số liệu không đủ điều kiện để trình bày như các kết quả trong bảng số liệu. Tuy nhiên, nồng độ kim loại nặng tích tụ trong mang, gan và thận cá đối chứng thu thập từ mặt cắt 1 cũng cao không kém các mẫu thu thập từ sông Nhuệ - Đáy.

27

Đa số các mẫu mơ thu thập (mang, gan, thận) có nồng độ Zn cao nhất, tiếp theo là Cu, Pb và thấp nhất là Cd. Ngoại trừ trường hợp gan cá rô phi ở cả bốn mặt cắt (mặt cắt 2, 3, 4, 5) đều có nồng độ Cu tích tụ ở mức cao nhất (cao hơn rất nhiều nồng độ Zn) là một trường hợp cá biệt cần được lưu tâm. Sự khác biệt giữa nồng độ các kim loại nặng tích tụ trong mang, gan, thận giữa các mặt cắt không thực sự rõ ràng, ngoại trừ một số trường hợp ngoại lệ như sau:

Ở cá chép, các mẫu thu thập tại mặt cắt 2 và 3 có nồng độ Cu trong gan cao hơn hẳn hai mặt cắt 3 và 4. Ngoài ra, ở mặt cắt 4, nồng độ Zn trong gan,