CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI IỆU
2.4. Phân tích mẫu
2.4.1. Phân tích kim loại nặng
Trong nghiên cứu này, căn cứ vào chức năng sinh học, độc tính và mức độ phổ biến mà chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu trên 4 kim loại nặng sau: đồng (Cu), cadmium (Cd), kẽm (Zn) và chì (Pb).
Phân tích dựa trên phương pháp của Gerstmann và Frank và được cải tiến bởi TS. Ngô Thị Thúy Hường (2010). Trong đó, mẫu mơ được chuyển vào ống thuỷ tinh 40 mL đã chuẩn bị trước. Mẫu sau đó được vơ cơ hố bằng hỗn hợp acid HNO3 65% + HCL 30% theo tỉ lệ 4:1 và để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ trước khi H2O2 tinh khiết được cho vào và để yên trong 5 giờ nữa. Sau đó mẫu được xếp vào hộp nhựa chịu nhiệt kín và vơ cơ hố trong lị ở nhiệt độ 120°C trong vòng 5 tiếng tới khi mẫu được vơ cơ hố hồn tồn (trong và khơng có bọt). Mẫu được để nguội ở nhiệt độ phịng trước khi pha lỗng với nước cất đến 20 mL và lọc bằng màng lọc xen-lu-lơ 0.45 µm (cellulose filter) gắn với xi lanh 10 mL. Mẫu sau đó sẽ được cất ở 4°C trong vòng 2 tháng hoặc ở -20°C trong vòng 6 tháng đến khi đo nồng đồ kim loại nặng trên máy khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS).
Mỗi tập mẫu phân tích chuẩn bị một mẫu hiệu chuẩn kiểm chứng và 1 mẫu trắng (chỉ chứa hỗn hợp acid HNO3 65% + HCL 30% theo tỉ lệ 4:1) và cũng tiến hành các bước chuẩn bị như mẫu phân tích. Bằng cách đó cho phép chúng ta hiệu đính các sai số bất thường gây ra bởi qua trình vơ cơ hố và đo mẫu.
2.4.2. Phân tích protein
Mẫu được rã đơng trên đá lạnh trước khi đem nghiền bằng máy nghiền mô trên đá lạnh và ly tâm lạnh ở 9205 rpm, 4o
C trong 15 phút. Thu dung dịch nổi vào ống eppendorf mới. Cặn lắng được nghiền trong dung dịch TBS và ly tâm lại thêm một lần nữa để thu càng nhiều enzyme càng tốt. Dung dịch nổi sau đó được giữ lạnh ở 0°C nếu phân tích trong ngày hoặc ở -20°C nếu phân tích trong tuần. Nồng độ protein sẽ được xác định bằng phương pháp Bradford trên đĩa 96 giếng. Tóm tắt quy trình như sau: Hồ tan protein trong 100 µL mẫu đã nghiền và ly tâm ở trên với 900 µL dung dịch 0.01 N NaOH (hệ số pha loãng DF = 10), trộn mẫu đều bằng Vortexer trong khoảng 10 giây. Sau đó sử dụng phương pháp Bradford BSA để xác định protein tổng số. Dung dịch làm việc BSA 250 µg/mL được pha để chuẩn bị dãy chuẩn protein cho mỗi tập mẫu phân tích theo các nồng độ protein trong khoảng 5 - 60 µg protein/mL bằng cách pha loãng với dung dịch đệm TBS. Chuẩn bị dãy chuẩn song song với q trình thao tác mẫu; Pha lỗng mẫu với dung dịch đệm A để có nồng độ tương đương 5 - 60 µg/ml BSA. Ủ hỗn hợp mẫu pha loãng và dãy chuẩn trong 30 phút ở 60°C trong tủ sấy. Mẫu sau khi để nguội ở nhiệt độ phịng sẽ được phân tích với 3 lần lặp lại trên đĩa 96 giếng. Cụ thể, cho 30 µl dung dịch chuẩn hoặc mẫu vào mỗi giếng, sau đó cho tiếp 150 µl dd Bradford Reagent 3x (pha loãng 3 lần), lắc trong 30 giây. Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong vòng 5 - 45 phút. Đo độ hấp thụ ánh sáng (mật độ quang) ở bước sóng 595 nm (kính lọc tham chiếu 495 nm). Độ hấp thụ của mẫu phải được ghi lại trước thời hạn 60 phút và trong vịng 10 phút. Vẽ hình mật độ quang theo từng nồng độ tương ứng của mẫu chuẩn. Nồng độ protein được xác định dựa trên đường cong chuẩn và chuẩn hoá cho trọng lượng ướt hoặc khơ của mẫu mơ (µg/g trọng lượng tươi hoặc mg/g trọng lượng tươi).
2.4.3. Phân tích GST
Hoạt tính GST được xác định bằng phương pháp Habig [29]: Mẫu được nghiền và ly tâm ở 4°C, 9.000xg (tương đương 9205 rpm đối với máy ly tâm 5417R Eppendorf) trong 30 phút. Lặp lại quy trình trên hai lần và kết hợp phần dung dịch nổi phía trên (supernatant) thu được từ hai lần ly tâm vào 1 ống
23
định hoạt tính của GST. Dung dịch phản ứng bao gồm hỗn hợp của 100 mM DPBS đệm (pH = 6,5), 200 mM GSH và 100 mM CDNB có nồng độ là 2 mM GSH và 1 mM CDNB. Phản ứng được bắt đầu bằng cách trộn 0,98 hoặc 0,95 ml hỗn hợp phản ứng với 0,02 hoặc 0,05 ml mẫu, tương ứng và độ hấp thụ của từng mẫu được đo 1 phút/ 1 lần trong vòng 7 phút ở 340 nm sử dụng máy đo quang phổ nhiệt Sciencetific TM Biomate. Cứ mỗi tập mẫu đo có một mẫu trắng (có chứa 1 ml dung dịch chất nền). Hoạt tính của enzyme được xác định lặp lại 2 lần và được thể hiện bằng µmol chất nền bị thuỷ phân trong 1 phút, trên 1 mg protein.
Hoạt tính của GST đã được tính tốn dựa trên cơng thức với các hệ số được tính tốn bằng cách sử dụng các yếu tố thay thế 9,6 mM-1cm-1 và cuối cùng tính nmol GSH-CDNB conjugate / phút / mg protein.