rankl:HSE:CFP ĐỒNG ĐỀU VỀ DI TRUYỀN VỚI GEN CHUYỂN
1.5.1. Các cá thể cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu có mức độ tổn thƣơng xƣơng khơng đồng nhất do có đặc điểm di truyền của gen chuyển khác nhau xƣơng khơng đồng nhất do có đặc điểm di truyền của gen chuyển khác nhau
Dòng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu đƣợc nhận từ ĐHQG Singapo
bao gồm các cá thể có mức độ bị tổn thƣơng xƣơng khống hóa khác nhau dƣới cùng một điều kiện sốc nhiệt [78] (Hình 1.5B) . Sự tổn thƣơng khơng đồng đều này có thể là do sự khơng đồng nhất về đặc điểm di truyền của gen chuyển rankl nhƣ giải thích ở Hình 1.6 gây ra do hạn chế của kĩ thuật chuyển gen (chuyển bằng kỹ thuật dùng meganuclease) và do cách dòng cá này đƣợc duy trì (duy trì bằng cách nội phối qua nhiều thế hệ).
Hình 1.6: Sự khơng đồng nhất về di truyền với gen chuyển của cá chuyển gen
rankl:HSE:CFP ban đầu
Cá chủng dại với màu cam nhạt, cá chuyển gen với các mức màu xanh tương ứng với đặc điểm di truyền của gen chuyển khác nhau. (1): Tạo cá chuyển gen rankl:HSE:CFP bằng cách tiêm plasmid mang gen chuyển (ơ xanh tím than) vào phôi cá chủng dại giai đoạn một tế bào, kết quả là tạo ra các cá thể cá chuyển gen (founders; đại diện bởi F01, F02, F03) khác nhau về đặc điểm di truyền của gen chuyển (về vị trí của gen chuyển trong hệ gen và số bản copy của gen chuyển). (2) Việc duy trì dịng cá bằng cách hỗn phối qua nhiều thế hệ cũng làm các cá thể của dòng cá này (progenitor founders; đại diện bởi PG1, PG2, PG3) không đồng nhất về di truyền của gen chuyển giữa các cá thể.
Sự khác nhau về vị trí đoạn chèn cũng nhƣ số đoạn chèn chứa gen chuyển
rankl trong hệ gen của các cá thể có thể dẫn tới mức độ biểu hiện Rankl khác nhau
gây ra các mức độ tổn thƣơng xƣơng khác nhau ở các cá thể cá chuyển gen ban đầu. Sự không đồng nhất về mức độ tổn thƣơng xƣơng ở các cá thể cá chuyển gen ban đầu này gây khó khăn trong việc sử dụng dịng cá làm mơ hình bệnh lỗng xƣơng để đánh giá hoạt tính của chất chống lỗng xƣơng. Do vậy, chúng tơi phải tiến hành lai để phân tách dịng cá gốc tìm ra một số dịng cá có sự đồng nhất về di truyền với gen chuyển rankl và kiểu hình lỗng xƣơng trong các cá thể cùng dòng.
1.5.2. Cá dị hợp tử một đoạn chèn với gen chuyển rankl:HSE:CFP có thể đƣợc dùng làm nguồn để tạo các dòng cá đồng nhất về di truyền và kiểu hình lỗng dùng làm nguồn để tạo các dòng cá đồng nhất về di truyền và kiểu hình lỗng xƣơng
Chúng tơi phải tiến hành lai ngoại phối và lai phân tích cá chuyển gen
rankl:HSE:CFP ban đầu với cá chủng dại để phân tách dịng cá này nhằm tìm ra các
cá thể cá có thể làm nguồn để tạo ra các dòng cá đồng nhất về di truyền với gen chuyển; chúng tôi hi vọng sự đồng nhất về di truyền này sẽ mang lại sự đồng nhất về mức độ tổn thƣơng xƣơng (kiểu hình lỗng xƣơng) ở các dịng cá lai tách đƣợc. Khi các cá thể mang gen chuyển rankl:HSE:CFP ban đầu (đƣợc coi là thế hệ F0, thế hệ bắt đầu tiến hành phân tách) giao phối với cá chủng dại, gen chuyển sẽ phân ly đến cá con F1 một cách ngẫu nhiên tạo ra các cá thể với các kiểu gen (đối với gen chuyển) khác nhau (Hình 1.7), trong đó có thể có cá thể có kiểu gen chứa một đoạn chèn với gen chuyển. Chúng tơi chỉ quan tâm đến việc tìm ra những cá thể cá F1 dị hợp tử một đoạn chèn này vì chúng có thể đƣợc dùng làm nguồn tạo các dòng cá đồng nhất về di truyền với gen chuyển. Chúng có thể dễ dàng đƣợc tìm ra vì khi lai phân tích cá này với cá chủng dại sẽ cho cá con với tỉ lệ số cá thể mang gen chuyển : không mang gen chuyển tuân theo tỉ lệ phân ly 1:1 của Men đen (Hình 1.8). Tỉ lệ này có thể dễ dàng kiểm tra bằng phép kiểm định định tính Khi bình phƣơng.
Hình 1.7: Các kiểu gen với gen chuyển (kí hiệu bởi đoạn màu xanh tím than) có thể có ở thế hệ F1 khi lai ngoại phối cá rankl:HSE:CFP ban đầu (F0) với cá
chủng dại.
Do phương pháp chuyển gen và cách duy trì bằng nội phối, cá F0 có thể có hệ gen chứa nhiều bản sao hay đoạn chèn của gen chuyển ở những nhiễm sắc thể khác nhau, khi lai nó với cá chủng dại, gen chuyển phân ly ngẫu nhiên tạo các cá F1 có kiểu gen đa dạng (điều này có thể giải thích cho sự khơng đồng đều về mức độ tổn thương xương của các cá ban đầu). Một số cá thể có thể vẫn mang nhiều đoạn chèn của gen chuyển trên cùng một nhiễm sắc thể (đại diện bởi cá thể được đánh dấu với vòng tròn màu xanh da trời) hay trên các nhiễm sắc thể khác nhau (vòng tròn màu xanh lá cây), một số cá thể chỉ mang một đoạn chèn của gen chuyển (vòng tròn màu đỏ) là đối tượng chúng tơi tìm kiếm để làm nguồn tạo các dòng cá đồng đều về di truyền với gen chuyển. Cá rankl:HSE:CFP ban đầu biểu thị bằng màu xanh lá, cá chủng dại (WT) với màu cam, các cá thể cá F1 kí hiệu bởi các vịng trịn bên trong có hệ gen chứa gen chuyển (đoạn màu xanh tím than) trên các nhiễm sắc thể đại diện (các thanh màu tím hồng).
Hình 1.8: Tỉ lệ phân ly 1:1 của gen chuyển theo Menđen ở cá con F2 khi lai phân tích cá thể F1 dị hợp tử một đoạn chèn của gen chuyển với cá chủng dại
Cá chuyển gen F1 biểu thị bằng màu xanh lá, cá chủng dại (WT) bằng màu cam; hệ gen của các cá thể cá F1 và F2 được biểu diễn bởi các vòng tròn màu đỏ bên trong có các nhiễm sắc thể đại diện (biểu thị bằng các thanh màu tím hồng) chứa một đoạn chèn của gen chuyển (biểu thị bằng đoạn màu xanh tím than) hay cá chủng dại (vịng trịn màu cam) khơng chứa gen chuyển.