XƢƠNG CỦA BỐN DÕNG CÁ c7, c9d1, d1, d4d1
Sau khi đã phân tách đƣợc bốn dòng cá c7, c9d1, d1, d4d1 dị hợp tử với một đoạn chèn của gen chuyển, chúng tơi phân tích mức độ biểu hiện và hoạt động của gen chuyển CFP và rankl ở những dịng cá này. Chúng tơi hy vọng ở bốn dịng cá này mỗi dịng đều có các cá thể có sự tổn thƣơng xƣơng đồng đều thể hiện ở một mức độ và bốn dòng cá thể hiện bốn mức độ tổn thƣơng xƣơng (kiểu hình giống lỗng xƣơng) khác nhau để có thể chọn đƣợc dịng cá có mức độ tổn thƣơng xƣơng phù hợp cho các nghiên cứu sàng lọc và đánh giá tác dụng của hoạt chất chống lỗng xƣơng. Hơn nữa, vì ở các dịng cá này CFP và Rankl biểu hiện đồng thời khi có sốc nhiệt [78] nên mức độ biểu hiện CFP của mỗi dịng cá có thể tƣơng quan thuận với mức độ biểu hiện Rankl và là chỉ thị cho mức độ bị hủy xƣơng của dòng cá đó. Do đó, chúng tơi phân tích và so sánh mức độ biểu hiện CFP và kiểu hình lỗng xƣơng ở bốn dịng cá này.
3.2.1. Sự biểu hiện huỳnh quang CFP
các phôi này đƣợc quan sát bằng kit soi huỳnh quang CFP. Phôi mang gen chuyển của cả bốn dịng đều có biểu hiện CFP và các phơi cá cùng dịng biểu hiện CFP đồng đều nhau (Phụ lục 02). Tuy nhiên, với cùng một điều kiện sốc nhiệt, phôi của bốn dịng có bốn mức độ biểu hiện CFP khác nhau. Tín hiệu huỳnh quang CFP quan sát đƣợc ở bốn dòng cá xếp theo thứ tự từ yếu nhất đến mạnh nhất tƣơng ứng là c7 < c9d1 < d1 < d4d1 (Hình 3.1).
Hình 3.1: Các mức độ biểu hiện CFP của phơi từ bốn dịng cá c7, c9d1, d1, d4d1
Phơi thu được từ bốn dịng cá trên được sốc nhiệt lúc một ngày tuổi trong 30 phút ở 39o
C. Thứ tự ảnh từ trái sang phải: Đối chứng: phôi không biểu hiện CFP (n=32), c7: phôi cá
cá dòng d4d1 (n=33). Hàng trên cùng: phơi cá của các dịng được chụp dưới ánh sáng thường (BF – Bright-field); Hai hàng dưới: các phôi cá này được chụp ở điều kiện kích thích CFP với chế độ ánh sáng màu (hàng thứ 2) và chế độ ánh sáng đơn sắc (hàng thứ 3). Thước chuẩn: 0,72 mm
3.2.2. Kiểu hình giống lỗng xƣơng của bốn dịng cá c7, c9d1, d1, d4d1
Kiểu hình giống lỗng xƣơng ở cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP có thể đƣợc tạo ra bằng cách sốc nhiệt phôi cá 9 ngày tuổi ở 39ºC trong 2 giờ [78]. Để phân tích kiểu hình lỗng xƣơng đƣợc cảm ứng ở bốn dịng cá dị hợp tử c7, c9d1, d1, d4d1, chúng tôi đã sốc nhiệt đồng thời ấu trùng cá của bốn dòng này vào 9dpf, sau hai ngày, vào 11dpf nhuộm xƣơng bằng thuốc nhuộm Alizarin Red để phân tích sự tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá. Đồng thời, chúng tơi cũng tiến hành thí nghiệm tƣơng tự với phôi của cá đối chứng là cá không mang gen chuyển thu đƣợc khi sàng lọc cá chuyển gen. Trên hình ảnh chụp ấu trùng cá đã nhuộm xƣơng, mơ xƣơng đang đƣợc khống hóa của nó bắt màu thuốc nhuộm Alizarin Red màu tím đỏ, các vùng xƣơng bị tổn thƣơng không bắt màu thuốc nhuộm tạo khoảng trống với màu nền của ảnh. Sự khống hóa xƣơng ở ấu trùng cá đối chứng và sự tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá của bốn dòng c7, c9d1, d1, d4d1 khi cá 11 ngày tuổi đƣợc trình bày ở các phần tiếp theo.
3.2.2.1. Sự khống hóa xương của ấu trùng cá đối chứng 11 ngày tuổi
Cấu trúc bộ xƣơng của cá medaka gồm 3 phần: xƣơng đầu, xƣơng cột sống và xƣơng vây. Một trong những ƣu điểm của cá medaka là các cấu trúc xƣơng phát triển khá nhanh, đặc biệt là xƣơng cột sống [2, 3]. Ở cá trƣởng thành có khoảng 30 đốt sống [41], mỗi đốt sống có cấu trúc gồm xƣơng cung thần kinh (neural arch – na), xƣơng cung mạch máu (hermal arch – ha) và xƣơng thân đốt sống (centrum – ct) [3]. Ở giai đoạn 10 ngày tuổi, phần đầu của ấu trùng cá medaka đã xuất hiện hầu hết những xƣơng cơ bản nhƣ: xƣơng lỗ tai (otolith – ot), xƣơng gốc bƣớm
basilar plate, supraoccipital); phần cột sống bao gồm khoảng 27 đốt sống đã đƣợc khống hóa chỉ cịn khoảng 2-3 đốt cuối phía đi vẫn đang tiếp tục đƣợc khống hóa, mặc dù xƣơng cung thần kinh đã hình thành ở 6-7 đốt sống đầu tiên nhƣng xƣơng cung mạch máu vẫn chƣa xuất hiện; các tia vây đi đã hóa xƣơng và trở nên rõ ràng [2]. So với cá 10dpf, các cấu trúc xƣơng của ấu trùng cá 11dpf khơng có sự thay đổi nhiều, điều đáng chú ý ở thời điểm này là cột sống đã có khoảng 27-29 đốt sống và xƣơng cung thần kinh đã xuất hiện ở 18-20 đốt sống kể từ phía đầu (Hình 3.2).
Hình 3.2: Sự khống hóa xƣơng của ấu trùng cá đối chứng 11 ngày tuổi
(A) Cấu trúc xương khống hóa của cá đối chứng ở 11 ngày tuổi, sb = 0,58 mm. (B) Hình ảnh một số cấu trúc xương đặc trưng ở phần đầu như xương gốc bướm (parasphenoid – ps), xương nắp mang (operculum – op), branchiostegay rays (br), anterior basicranial commissure (abc), xương răng (dentary – den), hyosymplectic (hys). (C) Hình ảnh phóng đại một phần đốt sống từ ơ vng ở hình A cho thấy cấu trúc thân đốt sống (mũi tên màu trắng), cung thần kinh (đầu mũi tên màu trắng. Thước chuẩn: 0.089 mm
3.2.2.2. Sự tổn thương xương của ấu trùng cá dòng c7
Hình ảnh nhuộm xƣơng của ấu trùng cá dịng c7 vào 11 ngày tuổi, hai ngày sau khi ấu trùng bị sốc nhiệt cho thấy sự tổn thƣơng ở một số cấu trúc xƣơng khống hóa (Hình 3.3). Ở phần xƣơng đầu của ấu trùng, chúng tôi chỉ thấy xƣơng đỡ nắp mang (cleithrum – cl) bị đứt gãy, mất một phần hoặc bị mảnh hơn ban đầu (Hình 1 phần Phụ lục 03) trong khi hầu hết các cấu trúc xƣơng cịn lại khơng bị tổn thƣơng. Tuy nhiên, sự tổn thƣơng xƣơng đƣợc thấy rất rõ ở xƣơng cột sống với sự mất đi một phần của các xƣơng cung thần kinh ở các đốt sống phần đầu (Hình 3.3, đầu mũi tên màu đỏ trong B’, C’, D’) và mất gần nhƣ hoàn toàn các xƣơng cung thần kinh của các đốt sống phía sau (Hình 3.3, đầu mũi tên màu đen), mặc dù thân các đốt sống còn nguyên vẹn (Hình 3.3, mũi tên màu trắng ở B’, C’, D’). Sự tổn thƣơng này đƣợc quan sát thấy đồng đều ở các phôi cá thu từ dịng c7 (Hình 3.3 B’, C’, D’).
Hình 3.3: Sự tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá dòng c7 11 ngày tuổi
(A) Hình ảnh các cấu trúc xương nguyên vẹn của ấu trùng cá đối chứng. (B, C, D) Hình ảnh các cấu trúc xương của 3 ấu trùng cá dịng c7. (A’) Hình ảnh phóng đại vùng cột sống của ấu trùng cá đối chứng trong ơ ở Hình A cho thấy cột sống cịn nguyên vẹn với mỗi đốt
tương ứng ở hình B, C, D của các ấu trùng cá dòng c7, cho thấy sự tổn thương một phần (đầu mũi tên màu đỏ) hay bị mất hoàn toàn (đầu mũi tên màu đen) của các cung xương thần kinh. Thước chuẩn: A, B, C, D: 0,92 mm; A’, B’, C’, D’: 0,37 mm.
3.2.2.3. Sự tổn thương xương của ấu trùng cá dịng c9d1
Hình ảnh nhuộm xƣơng của ấu trùng cá dòng c9d1 cũng cho thấy sự tổn thƣơng xƣơng khống hóa đồng đều giữa các cá thể cùng dịng này. Ở phần xƣơng đầu chỉ có xƣơng đỡ nắp mang (cleithrum – cl) bị đứt gãy (Hình 1 phần Phụ lục 03), xƣơng gốc bƣớm (paraspheroid – ps) cũng mảnh hơn (Hình 2 phần Phụ lục 03); xƣơng cột sống có các cấu trúc thân đốt sống còn nguyên vẹn (chỉ bằng mũi tên màu trắng Hình 3.4 B’, C’, D’) nhƣng các xƣơng cung thần kinh bị tổn thƣơng (Hình 3.4). Mức độ tổn thƣơng xƣơng khoáng hóa ở ấu trùng cá dịng c9d1 theo chúng tơi quan sát đƣợc là mạnh hơn so với mức độ này của ấu trùng dịng c7. Ấu trùng dịng c9d1 chỉ có một vài đốt sống ở phần đầu cịn sót lại dấu vết của cung thần kinh (chỉ bằng đầu mũi tên màu đỏ Hình 3.4 B’, C’, D’) cịn những cung thần kinh của các đốt sống phần sau bị phá hủy hoàn toàn (chỉ bằng đầu mũi tên màu đen Hình 3.4 B’, C’, D’).
Hình 3.4: Sự tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá dòng c9d1 11 ngày tuổi
sống của ấu trùng cá đối chứng trong ơ ở Hình A cho thấy cột sống cịn nguyên vẹn với mỗi đốt sống bao gồm cung xương thần kinh (chỉ bằng đầu mũi tên màu trắng) và thân đốt sống (chỉ bằng mũi tên màu trắng). (B’, C’, D’) Hình ảnh phóng đại của vùng cột sống trong ơ tương ứng ở hình B, C, D của các ấu trùng cá dòng c9d1, cho thấy sự tổn thương một phần (đầu mũi tên màu đỏ) hay bị mất hoàn toàn (đầu mũi tên màu đen) của các cung xương thần kinh. Thước chuẩn: A, B, C, D: 0,92 mm; A’, B’, C’, D’: 0,37 mm.
3.2.2.4. Sự tổn thương xương của ấu trùng cá dòng d1
Ấu trùng cá dòng d1 đƣợc kích thích hủy xƣơng ở 9dpf và quan sát kiểu hình sau hai ngày khi đƣợc nhuộm với Alizarin Red cho thấy mức độ hủy khống hóa xƣơng đồng đều giữa các cá thể (Hình 3.5). Các cấu trúc xƣơng phần đầu của dòng cá này vẫn nguyên vẹn, chỉ có xƣơng gốc bƣớm (paraspheroid – ps) mảnh hơn (Hình 2 phần Phụ lục 03) và xƣơng đỡ nắp mang (cleithrum – cl) bị đứt gãy hoặc mất một phần (Hình 1 phần Phụ lục 03). Sự tổn thƣơng xƣơng khống hóa xảy ra rõ nhất ở phần cột sống với các đốt sống có các xƣơng cung thần kinh bị phá hủy gần nhƣ hồn tồn (chỉ bởi mũi tên màu trắng hình 3.5 B’, C’, D’) nhƣng các thân đốt sống còn ngun vẹn. Chỉ có một số đốt sống phía sau của một số ít ấu trùng dịng cá này vẫn còn gốc cung thần kinh rất ngắn (chỉ bởi đầu mũi tên màu đỏ Hình 3.5C’).
Hình 3.5: Sự tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá dịng d1 11 ngày tuổi
(A) Hình ảnh các cấu trúc xương nguyên vẹn của ấu trùng cá đối chứng. (B, C, D) Hình ảnh các cấu trúc xương của 3 ấu trùng cá dịng d1. (A’) Hình ảnh phóng đại vùng cột sống của ấu trùng cá đối chứng trong ơ ở Hình A cho thấy cột sống còn nguyên vẹn với mỗi đốt sống bao gồm cung xương thần kinh (chỉ bằng đầu mũi tên màu trắng) và thân đốt sống (chỉ bằng mũi tên màu trắng). (B’, C’, D’) Hình ảnh phóng đại của vùng cột sống trong ơ tương ứng ở hình B, C, D của các ấu trùng cá dòng d1, cho thấy sự tổn thương gần hết (đầu mũi tên màu đỏ) hay bị mất hoàn toàn (đầu mũi tên màu đen) của các cung xương thần kinh. Thước chuẩn: A, B, C, D: 0,92 mm; A’, B’, C’, D’: 0,37 mm.
3.2.2.5. Sự tổn thương xương của ấu trùng cá dòng d4d1
Ấu trùng cá dòng d4d1 bị tổn thƣơng xƣơng rất mạnh. Hình ảnh nhuộm xƣơng ấu trùng 11 ngày tuổi sau hai ngày sốc nhiệt cho thấy, ở phần đầu có xƣơng đỡ nắp mang (cleithrum – cl) bị mất gần hết và xƣơng gốc bƣớm (paraspheroid – ps) bị mảnh hơn nhiều so với cá đối chứng (Phụ lục 03). Điều đáng chú ý là, xƣơng cột sống của những ấu trùng dòng cá này bị tổn thƣơng nghiêm trọng với những đốt sống có các cung thần kinh bị phá hủy tồn bộ (chỉ bởi đầu mũi tên màu đen Hình 3.6 B’, C’, D’) và thân đốt sống cũng bị phá hủy rất nặng (đƣợc chỉ bởi mũi tên màu đỏ trong Hình 3.6 B’, C’, D’)
Hình 3.6: Sự tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá dòng d4d1 11 ngày tuổi
(A) Hình ảnh các cấu trúc xương nguyên vẹn của ấu trùng cá đối chứng. (B, C, D) Hình ảnh các cấu trúc xương của 3 ấu trùng cá dòng d4d1. (A’) Hình ảnh phóng đại vùng cột của ấu trùng cá đối chứng trong ơ ở Hình A cho thấy cột sống cịn ngun vẹn với mỗi đốt sống bao gồm cung xương thần kinh (chỉ bằng đầu mũi tên màu trắng) và thân đốt sống (chỉ bằng mũi tên màu trắng). (B’, C’, D’) Hình ảnh phóng đại của vùng cột sống trong ô tương ứng ở hình B, C, D của các ấu trùng cá dịng d4d1, cho thấy các cung xương thần kinh bị mất hoàn toàn (đầu mũi tên màu đen), vùng thân đốt sống bị tổn thương nặng (mũi tên màu đỏ). Thước chuẩn: A, B, C, D: 0,92 mm; A’, B’, C’, D’: 0,37 mm.
3.2.2.6. So sánh kiểu hình giống lỗng xương của bốn dòng cá c7, c9d1, d1, d4d1
Quan sát và phân tích hình ảnh nhuộm xƣơng của ấu trùng cá 11 ngày tuổi của bốn dòng cá tách đƣợc sau khi đã đƣợc gây kiểu hình giống lỗng xƣơng bằng sốc nhiệt, chúng tôi đánh giá và xếp loại mức độ tổn thƣơng trên xƣơng cột sống của các dòng cá này từ nhẹ đến nặng là nhƣ sau: c7 < c9d1 < d1 < d4d1 (Hình 3.7). Ấu trùng cá dịng c7 và c9d1 có sự tổn thƣơng xƣơng ở mức độ nhẹ, tuy nhiên, dịng c9d1 có mức độ tổn thƣơng các cung xƣơng thần kinh mạnh hơn dòng c7 thể hiện ở nhiều đốt sống bị mất hoàn toàn và một số các đốt sống phần đầu chỉ còn một chút dấu vết cung xƣơng này (đầu mũi tên màu đỏ Hình 3.7 B, C). Ấu trùng cá dịng d1 có mức độ tổn thƣơng xƣơng trung bình với sự phá hủy hoàn toàn của các cung
rất ngắn (đầu mũi tên màu đỏ Hình 3.7D). Dịng d4d1 bị tổn thƣơng xƣơng mạnh nhất thấy rõ không chỉ ở sự mất hết các cung thần kinh mà còn ở sự tổn thƣơng nghiêm trọng ở phần thân của các đốt sống (mũi tên màu đỏ Hình 3.7E). Mức độ tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng các dòng cá này đã đƣợc chúng tôi định lƣợng và khẳng định bằng phƣơng pháp xác định chỉ số khống hóa của ấu trùng mà chúng tơi đã xây dựng đƣợc và trình bày ở các mục 3.4.1.2, 3.4.1.3, và 3.4.2.2.
Hình 3.7: So sánh kiểu hình lỗng xƣơng của bốn dịng cá c7, c9d1, d1, d4d1
Hình ảnh nhuộm xương cột sống của ấu trùng cá đối chứng (Hình A) và ấu trùng cá đại diện cho mỗi dòng c7, c9d1, d1, d4d1 được xếp theo mức độ tổn thương xương tăng dần từ trên xuống dưới tương ứng với các Hình B, C, D, E. Đầu mũi tên màu trắng chỉ đại diện
kinh bị mất một phần, đầu mũi tên màu đen chỉ đại diện gốc cung thần kinh bị mất hết, mũi tên màu trắng chỉ đại diện thân đốt sống còn nguyên vẹn, mũi tên màu đỏ chỉ thân đốt sống bị tổn thương.
3.2.3. Tổng kết kết quả lai tách dòng cá rankl:HSE:CFP
Từ các kết quả thu đƣợc ở phần 3.1 và 3.2 có thể tổng kết lại là chúng tơi đã lai tách đƣợc bốn dòng cá c7, c9d1, d1 và d4d1 từ cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu. Bốn dòng cá phân tách đƣợc biểu hiện CFP và sự tổn thƣơng xƣơng ở bốn mức độ khác nhau. Kết quả này có ý nghĩa rất lớn cho nghiên cứu tiếp theo sử dụng các dịng cá làm mơ hình sàng lọc chất chống lỗng xƣơng. Tùy thuộc vào hoạt tính của chất đƣợc kiểm tra mà dòng cá với mức độ tổn thƣơng xƣơng phù hợp sẽ đƣợc chọn làm mơ hình. Hơn nữa mức độ biểu hiện CFP khá tƣơng ứng với mức độ tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá mỗi dòng. Dòng cá c7 với mức độ biểu hiện CFP yếu nhất cũng có mức độ tổn thƣơng xƣơng yếu nhất; dòng cá d4d1 biểu hiện CFP mạnh nhất cũng có kiểu hình lỗng xƣơng mạnh nhất… Từ điều này chúng tơi thấy có thể dùng mức độ biểu hiện CFP nhƣ là một chỉ thị cho mức độ tổn thƣơng xƣơng của các ấu trùng cá đƣợc sử dụng.
Chúng tôi tổng kết và tóm tắt lại số liệu về các phép lai tách dòng cho bốn dòng cá này ở các sơ đồ trong Phụ lục 06.
3.3. PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỨC ĐỘ KHỐNG HĨA VÀ MỨC ĐỘ TỔN THƢƠNG XƢƠNG CỦA ẤU TRÙNG CÁ
Chúng tơi đã tách đƣợc bốn dịng cá rankl:HSE:CFP là c7, c9d1, d1, d4d1 có
sự đồng đều về di truyền với gen chuyển trong mỗi dòng. Để dùng các dòng cá này cho việc đánh giá tác dụng của các hợp chất có hoạt tính chống lỗng xƣơng, chúng tôi cần xây dựng đƣợc phƣơng pháp xác định hay định lƣợng mức độ khống hóa cũng nhƣ mức độ tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá 11dpf của mỗi dòng sau khi đã đƣợc sốc nhiệt tạo kiểu hình lỗng xƣơng (sốc nhiệt ở 39ºC trong 2 tiếng khi cá ở 9dpf). Qua hình ảnh nhuộm xƣơng của ấu trùng cá 11dpf, chúng tôi nhận thấy ấu
trùng cá rankl:HSE:CFP ở các dịng có sự tổn thƣơng xƣơng đƣợc thấy rõ nhất ở
cột sống, đặc biệt là ở 15 đốt sống đầu tiên. Sự tổn thƣơng đốt sống đƣợc chia thành hai loại:
1. Loại thứ nhất (kiểu hình lỗng xƣơng nhẹ và trung bình): các cung xƣơng thần kinh của các đốt sống bị tổn thƣơng hoặc bị mất nhƣ thấy ở ấu trùng cá dịng c7, c9d1, d1 (Hình 3.3, Hình 3.4, Hình 3.5)
2. Loại thứ hai (kiểu hình lỗng xƣơng nặng): các cung thần kinh của các đốt sống bị mất và thân đốt sống cũng bị tổn thƣơng nhƣ thấy ở ấu trùng cá dịng d4d1 (Hình 3.6)
Do vậy, chúng tơi xây dựng phƣơng pháp để xác định mức độ khống hóa hay tổn thƣơng xƣơng cho hai loại hình tổn thƣơng xƣơng này.
3.3.1. Phƣơng pháp định lƣợng gián tiếp mức độ khống hóa và tổn thƣơng xƣơng ở ấu trùng cá chỉ bị tổn thƣơng ở cung xƣơng thần kinh – Phƣơng pháp xƣơng ở ấu trùng cá chỉ bị tổn thƣơng ở cung xƣơng thần kinh – Phƣơng pháp Im cung thần kinh
3.3.1.1. Phương pháp Im cung thần kinh: tổng độ dài 15 cung xương thần kinh bên trái của 15 đốt sống đầu tiên làm đại diện cho chỉ số khống hóa Im của mỗi