Ảnh hƣởng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid

Hiệu suất

(%) Anconitin Atropin Brucin Colchicin Koumin Nicotin Scopolamin Strychnin

NaOH 0,1N 33 45 54 80 56 50 73 39

NH4OH 5% 83 74 80 116 112 103 120 95

Acid boric

Hình 3.17 : Biểu đồ ảnh hƣởng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid

Nhận xét: So sánh hiệu suất chiết của các chất phân tích cho thấy hiệu suất

chiết của hầu hết các alkaloid trừ nicotin đều cao hơn khi sử dụng dung dịch kiềm hóa là dung dịch NH4OH 5%. Do vậy chúng tôi lựa chọn dung dịch kiềm hóa là

dung dịch NH4OH 5%.

3.2.3. Khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa

Để khảo sát ảnh hƣởng của thể tích dung dịch kiềm hóa NH4OH 5% lên hiệu suất chiết các chất phân tích chúng tơi cố định các điều kiện chiết ở trên và

thay đổi thể tích dung dịch NH4OH 5% thêm vào lần lƣợt là 0,5; 1,0 và 2 mL. Tiến

hành làm lặp hai lần và lấy kết quả trung bình thu đƣợc nhƣ sau:

Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của thể tích dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid Hiệu

suất (%) Anconitin Atropin Brucin Colchicin Koumin Nicotin Scopolamin Strychnin

0,5 L 32 83 48 79 52 55 84 38

1 mL 83 112 72 108 108 97 108 89

Nhận xét: Từ bảng trên cho thấy khi sử dụng 0,5 mL dung dịch kiềm hóa cho

hiệu suất chiết một số chất thấp do chƣa đƣợc kiềm hóa hồn tồn. Khi sử dụng 2 mL dung dịch kiềm hóa thì hiệu suất chiết giảm đi rõ dệt do thể tích pha nƣớc lúc này tăng lên làm giảm hiệu suất chiết vào pha hữu cơ. Khi dùng 1 mL dung dịch kiềm hóa cho hiệu suất chiết của tất cả các chất là cao nhất do vậy chúng tôi sử

dụng 1mL dung dịch NH4OH 5% để kiềm hóa.

Kết luận: Vậy quy trình chiết tối ƣu của các alkaloid nhƣ sau:

Ch iế t lầ n 2 + 1 ml NH4OH 5% + 10 ml ethylacetat Lắc votex 5 phút

Cân 0,5g mẫu/ống ly tâm 50 ml

Hòa cắn bằng 5ml methanol Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút

Gạn dịch vào bình cơ, cơ quay ở 500C

Bã + 10 ml CHCl3

Vial, LC-MS/MS Lọc qua màng 0,2 µm

3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích

3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc

Để khẳng định phƣơng pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu/chọn lọc cao, chúng tơi đã tiến hành phân tích các mẫu trắng. Kết quả cho thấy mẫu trắng khơng có tín hiệu tại thời gian lƣu của chất phân tích. Mặt khác từ bảng 3.1 cho thấy tất cả các alkaloid nghiên cứu đều có 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con nên số điểm IP là 4 đạt theo yêu cầu của AOAC về điểm nhận dạng IP đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 2 lần. Nhƣ vậy, phƣơng pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu đáp ứng đƣợc yêu cầu.

3.3.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn

3.3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính

Pha lỗng dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1-10 µg/mL trong methanol để thu đƣợc các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,5-5; 1-10; 2-20; 5-50; 10-100; 20- 200; 50-500; 100-1000 ng/mL; 200-2000 ng/mL; 500-5000 ng/mL. Tiến hành chạy máy với các điều kiện tối ƣu ở trên. Vẽ đồ thị mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn, thu đƣợc các kết quả sau :

Hình 3.20: Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ Atropin trong khoảng 0,5-100 ng/mL

Hình 3.21: Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ aconitin trong khoảng 5-1000 ng/mL

Kết luận : Khoảng tuyến tính từ 5÷1000 ng/mL với các chất brucin, strychnin, koumin, aconitin, colchicin; khoảng tuyến tính từ 0,5 ÷ 100 ng/mL với

các chất nicotin, atropin và scopolamin. Tất cả đều cho hệ số tƣơng quan R > 0,9990, khoảng tuyến của các alkaloid là rộng. Do đó, chúng tơi tiến hành lập đƣờng chuẩn các alkaloid nằm trong khoảng tuyến tính của các chất.

3.3.2.2. Đường chuẩn

Lập mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ các alkaloid, thu

đƣợc kết quả sau: