1.3.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng-lỏng). Mẫu phân tích đƣợc chuyển lên cột tách dƣới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích đƣợc phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hố của các chất khác nhau, nên khả năng tƣơng tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [6]. Sau đó các chất phân tích đƣợc đƣa vào bộ phận phát hiện và ghi nhận thành tín hiệu sắc ký detector. Có rất nhiều loại detector nhƣ UV, RF, khối phổ….
Hiện nay, detector có thể cung cấp thơng tin định tính, định lƣợng và cấu trúc của các chất phân tích là detector khối phổ.
1.3.2. Detector khối phổ (Mass spectrometry – MS)
1.3.2.1. Nguyên tắc
Khối phổ (Mass spectrometry – MS) là dựa vào chất nghiên cứu đƣợc ion hóa trong pha khí hoặc pha ngƣng tụ dƣới chân khơng cao, tạo thành các ion có số khối khác nhau, các ion này đƣợc phân tách thành các mảnh theo tỉ số khối trên điện tích (m/z)[29]. Các ion này có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích nhƣ loại bỏ electron, proton hóa... Các ion tạo thành theo tỉ số m/z và phát hiện từ đó cho thơng tin về khối lƣợng hay cấu trúc phân tử của hợp chất.
Cấu tạo của thiết bị khối phổ gồm 3 bộ phận chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và detector. Các mẫu đƣợc ion hóa trong nguồn ion sau đó đƣa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z, các tín hiệu thu đƣợc sẽ chuyển vào máy tính xử lý và lƣu trữ.
1.3.2.2. Bộ nguồn ion (Ion sources)
Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó khăn lớn nhất ở đây là
phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi. Theo kỹ thuật ion hoá của LC/MS, năng lƣợng của máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoặc rắn để tạo thành ion ở thể hơi. Có nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhƣng hai kỹ thuật hay đƣợc sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ bao gồm:
a) Chế độ ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization - ESI)
Kĩ thuật ion hóa phun điện tử bao gồm ba quá trình cơ bản sau: - Tạo thành các giọt mang điện tích.
- Làm giảm kích thƣớc của các hạt, và phân nhỏ các hạt. - Quá trình hình thành pha hơi các ion.
Hình 1.1: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI
Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà ngƣời ta chọn kiểu bắn với chế độ ion dƣơng (+) hoặc ion âm (-). Kiểu bắn phá chế độ ion dƣơng thƣờng cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên đƣợc dùng phổ biến hơn.
- Loại hình thành ion dƣơng.
o Phù hợp nhất cho phân tích các loại chất phân tích có tính bazơ.
o Thƣờng hình thành nên ion [M+H]+.
o Cũng có thể hình thành ion [M+nH]n+ , [M+Na+]+
- Loại hình thành ion âm.
o Thích hợp nhất cho sự phân tích các loại chất phân tích có tính acid.
ESI là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao, ESI - MS thích hợp cho cả phân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng 100-150 amu) cũng nhƣ phân tử khối lớn của các phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi, khơng bền nhiệt, phân cực và không phân cực.
Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng kỹ thuật ion hố phun điện tử (ESI) bắn phá với chế độ ion dƣơng [29].
b) Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure Chemical Ionization-APCI)
Sự ion hóa trong APCI phụ thuộc vào sự va chạm của dòng ion dƣơng hay âm với phân tử, mẫu bị ion hóa bởi phản ứng với các ion đƣợc tạo ra từ các chất khí nhƣ methan (ở dạng CH5+), amoniac (ở dạng NH4+)...
1.3.2.3. Bộ phân tích khối phổ (analyser)
Bộ phân tích khối phổ có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau
thành từng phần riêng biệt. Sau khi đã đƣợc ion hoá, các ion đƣợc đƣa đến bộ phân tích khối nhằm loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thực hiện bắn pha thêm để thu đƣợc các ion con. Một số bộ phân tích khối phổ :
Bộ phân tích bẫy ion. Bộ phân tích thời gian bay. Bộ phân tích tứ cực.
a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole analyser)
Nguyên tắc: tạo ra một trƣờng tần số vô tuyến biến đổi (trƣờng tứ cực).Bộ phân tích tứ cực bao gồm 2 loại: Bộ phân tích tứ cực đơn, bộ phân tích tứ cực chập ba.
Bộ phân tích tứ cực đơn (Single focusing magnetic analyser): Có 4 cực bằng
kim loại đặt song song và theo hƣớng của chùm ion. Trƣờng tĩnh điện đƣợc tạo ra do thế một chiều (DC) và tần số radio (RF) đƣợc đặt vào các thanh. Các tứ cực nhƣ
bộ lọc khối, khi có điện trƣờng thì ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số m/z và từ trƣờng RF. Chỉ những ion phù hợp mới đi qua bộ lọc này.
Bộ phân tích tứ cực chập ba (Triplequad mass spectometry): Bộ phân tích khối
bao gồm ba bộ tứ cực ghép nối với nhau. Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2. Ở tứ cực thứ hai (Q2) các ion phân tử mẹ bị phân li do va chạm với khí trơ có mặt nhƣ khí N2, Ar, He, bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con. Q2 khơng đóng vai trị là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion do Q1 chuyển đến. Sau đó tất cả các ion con đƣợc chuyển qua bộ tách Q3. Bộ tứ cực thứ ba (Q3) làm nhiệm vụ tách các ion đƣợc chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện.
Hình 1.2: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực chập ba
Kỹ thuật MS một lần có nhƣợc điểm là khơng nghiên cứu đƣợc cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, chịu ảnh hƣởng rõ rệt của nền mẫu chất phân tích, trên phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử. Kỹ thuật MS/MS không chỉ khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm trên mà cịn tăng độ nhạy phân tích tới hàm lƣợng femtogram, tăng độ chính xác của kết quả phân tích, loại bỏ ảnh hƣởng của nền mẫu. Hệ MS/MS là hệ hai máy khối phổ độc lập đƣợc nối với nhau cách nhau buồng va chạm (Collision Cell) [29].
Các ion ra khỏi buồng ion hoá đƣợc gia tốc nhờ thế 10-20 kV bay qua một ống phân tích (khơng có trƣờng điện từ) có chiều dài đến 2m với cùng động năng. Tuy nhiên, tùy thuộc vào tỉ số m/z mà các ion có tốc độ khác nhau tới detector. Thời gian bay hết ống này đến detector tỷ lệ thuận với m z của các ion. Các ion sẽ đƣợc phát hiện ở các thời điểm khác nhau. Bộ phân tách này cho phổ tuyến tính với thang m/z.
c) Bộ phân tích tứ cực bẫy ion (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)
Bẫy tứ cực hoạt động theo nguyên lý bộ phân tích khối tứ cực, chỉ có một điểm khác là các ion đƣợc lƣu giữ và đƣa dần ra khỏi bẫy. Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực các ion có tỷ số m/z khác nhau có thể vƣợt qua khoảng khơng để đến detector. Các ion này cũng có thể bị bắn phá trong bẫy để thu đƣợc các ion con. Về nguyên tắc, loại phân tích khối phổ bẫy ion có thể làm đến MS nhiều lần.
Bộ phân tích khối ba tứ cực đƣợc sử dụng phổ biến trong kỹ thuật LC- MS/MS và đây chính là kỹ thuật đƣợc chúng tơi sử dụng trong nghiên cứu này.
1.3.2.4. Bộ phận phát hiện
Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion đƣợc đƣa tới phần cuối của
thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợc khuếch đại hoặc tạo ra một dịng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ phận phát hiện nhân electron.
1.3.3. Phân tích định tính và định lượng bằng LC-MS/MS
Đại lƣợng đặc trƣng cho sự tách sắc ký là thời gian lƣu của các chất do vậy
dựa vào thời gian lƣu của chất phân tích và sự phân mảnh phổ có thể định tính từng chất trong hỗn hợp. Dùng phƣơng pháp đƣờng chuẩn và thêm chuẩn để định lƣợng chất phân tích trong mẫu, đồng thời kiểm sốt độ thu hồi của phƣơng pháp.