2.1 Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
Nguy cơ tiềm ẩn ngộ độc do các alkaloid độc trong thực phẩm chức năng có
nguồn gốc thảo dƣợc đang đặt ra cho cơ quan thanh tra, kiểm tra thực phẩm cần có phƣơng pháp xác định chính xác các alkaloid độc để quản lý và cảnh báo đảm bảo an toàn và sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Phù hợp với thực tiễn, chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng một số alkaloid độc bao gồm (Brucin, Strychnin, Aconitin, Colchicin, Atropin, Scopolamin, Nicotin, Koumin) trong thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dƣợc bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ LC-MS/MS.
Mục tiêu tiến hành nghiên cứu của đề tài:
Tối ƣu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định đồng thời
các alkaloid.
Khảo sát, tối ƣu hóa q trình xử lý mẫu.
Thẩm định phƣơng pháp phân tích.
Ứng dung phƣơng pháp để phân tích trên một số mẫu thực tế.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
Phƣơng pháp nghiên cứu của luận văn này bao gồm:
Phƣơng pháp tách chiết mẫu:
Qua tham khảo các nghiên cứu ở trên chúng tôi lựa phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng. Mẫu đƣợc thêm dung dịch kiềm để chuyển các alkaloid về dạng bazơ sau đó các alkaloid đƣợc chiết vào pha dung môi hữu cơ.
Phƣơng pháp LC-MS/MS:
Mẫu sau khi tách chiết đƣợc đem đi phân tích trên hệ thống LC-MS/MS với chế độ ion dƣơng nguồn ESI, cơ sở lý thuyết đã đƣợc nêu trong phần tổng quan. Các kết quả đƣợc tính tốn tự động theo phần mềm phân tích của thiết bị (phần mềm Analyst 1.5.1, ABSciex).
Phƣơng pháp thẩm định:
Để đánh giá phƣơng pháp chúng tôi tiến hành theo quy định của AOAC. Phƣơng pháp thẩm định bao gồm:
- Tính đặc hiệu, tính chọn lọc
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng
- Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn
- Độ lặp lại và độ thu hồi
Phƣơng pháp lấy mẫu:
Đối tượng mẫu: Một số thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược Phương pháp lấy mẫu: Ngẫu nhiên
Địa điểm: Một số hiệu thuốc trên địa bàn nội thành Hà Nội
2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu
2.3.1 Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm:
+ Máy sắc ký lỏng của Shimadzu. Model 20 AD-UFLC. + Máy khối phổ. Model AB sciex Triplequard 5500
- Cột sắc ký InertSustain C18 (150mm × 4,6mm × 5μm). Nƣớc sản xuất Nhật
Bản
- Máy lắc xoáy ( vortex) VELP.
- Máy đồng nhất mẫu.
- Máy ly tâm MIKRO 22R có thể đạt đƣợc tốc độ tối thiểu 4000 rpm với ống ly
tâm 50 mL.
- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg) (Metter Toledo).
- Máy cất quay chân khơng có bể điều nhiệt EYELA
2.3.2 Dụng cụ
- Ống đong dung tích 10,50, 100 mL.
- Autopipet loại 100 µL, 1000 µL, 5000 µL,và đầu cơn tƣơng ứng.
- Ống ly tâm 50 mL.
- Màng lọc 0,2 µm.
- Vial loại 1,8 mL.
- Bình định mức dung tích 10, 25, 50, 100, 500 mL.
- Ống nghiệm thủy tinh có nắp 6mL
2.3.3 Chất chuẩn
- Các chất chuẩn: Nicotin đƣợc cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn
độ tinh khiết 98,7 % lọ 1 g; Koumin cung cấp bởi hãng Chengdu Biopurify ở dạng rắn độ tinh khiết 99,72 % lọ 10 mg; Atropin đƣợc cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 99 % lọ 1 g; Scopolamin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 99,3 % lọ 1 g; Brucin và Strychnin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 98% lọ 5g; Aconitin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 95 % lọ 5 mg; Colchicin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 95 % lọ 100 mg
- Dung dịch chuẩn gốc 100 µg/mL: cân chính xác 0,01g từng chất chuẩn trên
cân phân tích có độ đọc 0,0001g, hòa tan và định mức 100 mL bằng methanol. Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 năm.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian của nicotin, scopolamin và atropin (10
µg/mL): hút 1 mL dung dịch chuẩn gốc của mỗi chất vào bình định mức 10 mL, pha lỗng và định mức đến vạch bằng methanol. Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 tháng.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (1-10 µg/mL): hút 1 mL dung dịch chuẩn gốc của brucin, strychnin, koumin, aconitin, colchicin và 1 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian của nicotin, scopolamin, atropin (10 µg/mL) vào bình định mức 10 mL, pha lỗng và định mức đến vạch bằng methanol. Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 tuần.
- Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1-10 µg/mL trong methanol để thu đƣợc các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,5-5; 1-10; 2-20; 5-50; 10-100; 20-200; 50-500; 100-1000; 200-2000; 500-5000 ng/mL.
2.3.4 Các loại hóa chất, dung mơi khác
- Methanol (Merck 99,9%), Acetonitril (Merck 99,9%), acid formic (Merck 98%), acid acetic băng (Merck), amoniacetat (Merck), ethylacetat (Merck), ether (Merck), chloroform (Merck), NaOH (Merck), acid boric, …
- Nƣớc cất hai lần
- Dung dịch NaOH 0,1M: Cân 2g NaOH hòa tan và định mức bằng 500 mL nƣớc cất hai lần.
- Dung dịch KCl 0,1M: Cân 7,455g KCl hòa tan và định mức bằng 1000 mL
nƣớc cất hai lần.
- Dung dịch đệm borat pH 9: Cân 3,09 g acid boric hòa tan hòa tan bằng 500
mL dung dịch KCl 0,1M. Thêm tiếp 210 mL dung dịch NaOH 0,1M.
- Dung dịch NH4OH 5%: hút chính xác 5 mL dung dịch NH4OH vào bình 100
mL và định mức đến vạch bằng nƣớc cất.