CHƢƠNG 2 : THỰC NGHIỆM
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu – phƣơng pháp RP-HPLC
2.3.1. Nguyên tắc chung của phương pháp HPLC.
Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều q trình vừa có tính chất hố học lại vừa có tính chất lý học. Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách. Trong q trình đó chất tan ln ln đƣợc phân bố lại giữa hai pha, trong khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một tốc độ và thành phần pha động nhất định, hay gradient. Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong q trình sắc ký, nó ln chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ đầu cột đến cuối cột sắc ký. Mặt khác cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ di chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau. Khi ở trong pha động, nó dịch chuyển theo tốc độ của dịng pha động, cịn khi ở trên pha tĩnh nó lại khơng dịch chuyển mà bị pha tĩnh giữ lại trong một khoảng thời gian nhất định trong cột tách sắc ký, thời gian này phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cũng nhƣ cấu trúc và tính chất của mỗi chất tan khác nhau, đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha động dung môi để rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Vì thế trong q trình sắc ký có chất tan bị lƣu giữ lâu trên cột, có chất tan bị lƣu giữ ít. Điều đó dẫn đến kết quả có q trình tách các chất xảy ra trên cột sắc ký.
- Tƣơng tác hấp phụ - Tƣơng tác trao đổi ion
- Tƣơng tác theo cơ chế rây phân tử
Tƣơng tác với 3 cơ chế trên có 3 phƣơng pháp tiến hành tách khác nhau:
- Sắc ký hấp phụ (chất hấp phụ pha thƣờng NP-HPLC) và hấp phụ pha ngƣợc RP- HPLC).
- Sắc ký trao đổi ion (EX-HPLC) - Sắc ký rây phân tử (Gel-HPLC)
Nhƣ vậy phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC là một kỹ thuật tách chất trong đó xảy ra q trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi kích thƣớc nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố của nó. Các chất nhồi cột có kích thƣớc đủ nhỏ để đáp ứng hiệu quả tách sắc ký tốt. Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt đƣợc lực rửa giải phù hợp nhất. Sau khi chuyển tới cuối cột tách đƣợc chuyển tới detector để phát hiện. Tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan mà dùng các loại detector khác nhau.
Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
Hình 2.1. Sơ đồ chức năng của thiết bị HPLC
1. Bộ phận cấp dung môi (pha động) 2. Bơm cao áp
3. Van bơm mẫu 4. Cột tách (pha tĩnh) 5. Detector 6. Máy ghi tín hiệu
2.3.2. Phương pháp định tính và định lượng.
- Phương pháp phân tích định tính:
Nguyên tắc của các phép phân tích định tính là dựa vào một yếu tố đặc trƣng của tín hiệu tƣơng ứng với mỗi cấu tử để nhận diện chúng. Trong sắc kí lỏng ngƣời ta sử dụng yếu tố đặc trƣng là thời gian lƣu để nhận diện các cấu tử bằng cách so sánh thời gian lƣu của chúng với thời gian lƣu của chất chuẩn. Sử dụng phƣơng pháp HPLC – UV , ngồi việc nhận diện các cấu tử thơng qua yếu tố thời gian lƣu, chất cần phân tích cịn đƣợc nhận diện thơng qua việc so sánh cực đại hấp thụ đặc trƣng và cực đại hấp thụ của chất chuẩn với chất cần phân tích .
- Phương pháp phân tích định lượng:
Trong sắc kí, hai phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để định lƣợng chất phân tích là phƣơng pháp ngoại chuẩn và phƣơng pháp nội chuẩn. Nguyên tắc của phƣơng pháp ngoại chuẩn là so sánh trực tiếp độ lớn của các tín hiệu (diện tích hay chiều cao pic thu đƣợc) trong mẫu chƣa biết với dung dịch chuẩn của chất đó. Trƣớc tiên cần bơm dung dịch chuẩn của chất cần phân tích với các nồng độ thích hợp. Từ các kết quả thu đƣợc ta xây dựng đƣờng chuẩn có dạng: y = a + bx. Đo diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất cần phân tích (giá trị y) và áp vào đƣờng chuẩn ta có thể tính ra nồng độ cấu tử cần phân tích (giá trị x). Trong trƣờng hợp này, các thông số làm việc của máy nhƣ nhiệt độ, tốc độ dòng …phải rất ổn định, các lần bơm mẫu phải có độ lặp lại cao.