3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện chạy sắc ký.
3.1.1. Van bơm mẫu.
Hệ bơm mẫu cho sắc ký lỏng sử dụng nguyên lý cơ bản là mẫu ban đầu đƣợc nạp vào trong vòng chứa mẫu có thể tích nhất định bằng một xi lanh ở áp suất thƣờng, sau đó nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu đƣợc dòng pha động nạp trong cột tách. Độ chính xác, độ đúng và lƣợng mẫu cần thiết nạp vào cột tách không những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột.
Dựa vào khả năng thay đổi các vịng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi đƣợc thể tích mẫu bơm vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần vào việc mở rộng chân pic sắc ký (dỗng pic). Nếu nhƣ vịng mẫu chứa q dài, lƣợng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tƣợng doãng pic xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách.
Lƣợng mẫu đƣợc xác định bằng lƣợng thể tích vịng chứa mẫu mà ta chọn. Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn Vo thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích của pic sẽ tăng một cách tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu > Vo, nếu ta tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc ký cũng khơng tăng đƣợc nữa mà lúc đó pic sắc ký sẽ tù và dỗng , khơng sắc nét nữa. Vì vậy việc chọn thể tích vịng mẫu cũng rất quan trọng.
Nếu vòng mẫu quá dài, lƣợng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tƣợng dỗng chân pic càng cao. Nếu thể tích bơm mẫu là q nhỏ thì sai số cũng sẽ rất lớn, ví dụ nếu sai số của van bơm mẫu là 0,05l, khi bơm thể tích mẫu là 1l thì sai số sẽ là 5%, cịn nếu thể tích mẫu bơm là 25l thì sai số là 0,2%.
Ngày nay, van bơm mẫu 6 chiều rất phổ biến, vì vậy chúng tơi lựa chọn loại van này và thể tích mẫu bơm là 25l.
3.1.2. Cột tách.
Cột tách có vai trò rất quan trọng trong một phép tách sắc ký, nó quyết định hiệu quả tách của q trình. Để chọn đƣợc một pha tĩnh hay một cột tách phù hợp nhất ta phải dựa trên những đặc điểm nhƣ: độ phân cực của chất phân tích, chất phân tích đƣợc pha trong mơi trƣờng nhƣ thế nào, có pH ra sao thì mới quyết định chọn pha tĩnh phù hợp. Chất phân tích đƣợc chọn là các phtalat, không tan trong nƣớc, đƣợc pha trong ACN, chất phân tích kém phân cực nên phải sử dụng pha tĩnh có bản chất kém phân cực giống nhƣ chất phân tích. Vì vậy, cột pha đảo RP-HPLC là lựa chọn tối ƣu nhất. Trong điều kiện phịng thí nghiệm, chúng tơi đã sử dụng cột tách C18 inertsil ODS-3 (250mm × 2,1mm × 5µm) để tách các phtalat và định lƣợng chúng. Nhiệt độ cột 300C.
3.1.3. Detector.
Detector là một bộ phận có vai trị theo dõi, phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc ký chảy ra một cách liên tục, nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các chất hay hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích. Trên thực tế, hầu hết các chất nghiên cứu đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV – VIS, vì vậy detector UV – VIS thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu. Hiện nay mảng diot–photo–array phát triển, chúng có vai trị nhƣ một deetector UV – VIS, nhƣng chúng có khả năng theo dõi chất ở nhiều bƣớc sóng khác nhau ở cùng một thời điểm, và độ nhạy của nó cao hơn detector UV-VIS. Tuy nhiên, dựa vào điều kiện phịng thí nghiệm và mục tiêu của nghiên cứu, chúng tơi quyết định chọn detector PDA để phát hiện các chất phân tích.
3.1.4. Bước sóng hấp thụ cực đại của các phtalat.
Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn nghiên cứu định lƣợng 05 phtalat. Chúng có cấu tạo rất giống nhau. Chỉ khác nhau 2 nhóm R và R’ đƣợc thay bằng các gốc rƣợu khác nhau, vì vậy bƣớc sóng hấp thụ quang của các phtalat này đều giống nhau ở 224 nm. Dải phổ hấp thụ của các phtalat này đƣợc quét trên detector PDA từ 190 nm đến 700 nm. Hình 3.1 là phổ UV của 05 phtalat.