Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HĨA ENZYME GmMSRA CỦA ĐẬU
3.3.1.2. Chuyển gen GmMSRA6 vào vector pKS
Vector tách dòng pBluescript II KS (+/-) (pKS) sử dụng trong nghiên cứu có cấu trúc được minh họa trong hình 3.8.
Hình 3.8. Cấu trúc vector tách dịng pKS
Đoạn gen đích là sản phẩm PCR được tinh sạch bằng GeneAll® ExpinTM KIT,
vector tách dòng pKS đã được xử lý với enzyme giới hạn SmaI (NEB). Sử dụng
Quick Ligation TM KIT (NEB) để kết nối gen đích GmMSRA6 vào vector pKS. Dòng
vector tái tổ hợp pKS-GmMSRA6 được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Phương pháp sàng lọc thể biến nạp được sử dụng trong thí nghiệm này là sàng lọc xanh-trắng: Plasmid là pKS mang gen chọn lọc kháng ampicilin và gen β- galactosidase. Trong mơi trường có bổ sung X-Gal 50 mg/L (cơ chất nhân tạo của β-galactosidase) và chất cảm ứng IPTG 0,1 M thì các tế bào chứa plasmid mang gen mong muốn cho khuẩn lạc màu trắng, tế bào chứa plasmid không mang gen mong muốn cho khuẩn lạc màu xanh.
Tinh sạch plasmid pKS-GmMSRA6 từ dịch ni khuẩn lạc có màu trắng sử dụng GeneAll® ExprepTM KIT. Plasmid sau khi tinh sạch được xử lý đồng thời với 2
enzyme giới hạn SpeI và SalI (NEB). Trình tự nhận biết của 2 enzyme được minh
họa trong hình 3.9.
Hình 3.9. Vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn
Hình 3.10. Kết quả biến nạp gen GmMSRA6 vào vector pKS
Giếng 1: Thang chuẩn 1 kb; Giếng 2: Vector tái tổ hợp pKS-GmMSRA6 sau khi xử lý với SpeI và SalI
Kết quả điện di cho thấy, vector tái tổ hợp pKS-GmMSRA6 chứa trình tự nhận biết của 2 enzyme giới hạn SpeI và SalI, do đó sau phản ứng cắt trên bản điện di xuất hiện 2 băng: vector pKS và gen chuyển GmMSRA6. Hai băng ADN đều
sáng và rõ nét, đặc biệt băng GmMSRA6 thu được có kích thước mong đợi.
Plasmid pKS mang đoạn ADN mã hóa cho GmMSRA6 sau đó được giải trình tự và so sánh với trình tự đã được cơng bố trên ngân hàng gen đã khẳng định tính chính xác của kết quả tách dòng gen. Như vậy, plasmid tái tổ hợp pKS-GmMSRA6 thu được đạt độ tin cậy để tiến hành các thí nghiệm tiếp sau.