Cấu trúc các gen mã hóa cho GmMSRA đều có sự xen kẽ giữa các đoạn exon và intron, đa số gen gồm hai exon (5/7 gen) xen kẽ một intron (4/7 gen), riêng
GmMSRA1 và GmMSRA6 có số lượng exon và intron lớn nhất (4 exon, 3 intron).
Đoạn intron thường có kích thước lớn gấp nhiều lần so với các đoạn exon. Ở
GmMSRA2, GmMSRA4 và GmMSRA7 xuất hiện đoạn exon có kích thước khá lớn
so với các đoạn exon khác thuộc cùng một gen hoặc giữa 2 gen khác nhau. Số lượng exon và intron của các GmMSRA được thống kê trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Số lượng exon và intron của các GmMSRA
Tên gen Kích thước (bp) Số lượng
ADN genome ADN mã hóa Exon Intron
GmMSRA1 5049 753 4 2 GmMSRA2 2758 801 2 1 GmMSRA3 2246 585 2 1 GmMSRA4 4104 612 2 1 GmMSRA5 2463 801 2 1 GmMSRA6 4765 753 4 2 GmMSRA7 3188 804 2 2
Từ kết quả những phân tích trình bày ở trên, chúng tôi nhận thấy 3 cặp
GmMSRA có sự tương đồng khá cao trong trình tự chuỗi polipeptide, đó là GmMSRA1 và GmMSRA6, GmMSRA2 và GmMSRA5, GmMSRA4 và GmMSRA7,
rất có khả năng các gen này được hình thành do hiện tượng nhân đôi hệ gen (genome duplication). Sử dụng cơ sở dữ liệu chibba.agtec.uga.edu/duplication/,
với kết quả phân tích có được, dựa trên số lượng locus gen tương đồng được tìm thấy trên các nhiễm sắc thể (NST) chúng tơi có thể kiểm chứng giả thiết đặt ra ở trên (hình 3.3)
Hình 3.3. Các GmMSRA được hình thành do nhân đơi hệ gen
Trên NST số 2 (chứa locus gen mã hóa cho GmMSRA2) và NST số 14 (chứa locus gen mã hóa cho GmMSRA5) tìm thấy số lượng rất lớn vị trí các locus gen
tương đồng, chúng tơi dự đốn khả năng cao 2 GmMSRA này là gen lặp lại của
nhau. Đối với GmMSRA1 (NST số 2) và GmMSRA6 (NST số 16), GmMSRA4 (NST số 8) và GmMSRA7 (NST số 18) cũng ghi nhận nhiều vị trí locus gen tương đồng
nhưng với kết quả này chúng tôi chưa thể khẳng định một cách chắc chắn 2 cặp
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN MÃ HÓA MSRA TRONG HỆ GEN ĐẬU TƯƠNG HÓA MSRA TRONG HỆ GEN ĐẬU TƯƠNG
3.2.1. Đánh giá mức độ biểu hiện của các GmMSRA ở các mô khác nhau
Sử dụng cơ sở dữ liệu của Libault và cs (2010) cho phép đánh giá mức độ biểu hiện của 7 gen mã hóa cho GmMSRA ở hệ gen đậu tương trong 9 loại mô khác nhau bao gồm: Mô tế bào lông hút được phân lập sau 84 giờ và sau 120 giờ gieo hạt, mô tế bào đầu mút rễ, nốt sần, mô phân sinh đỉnh chồi, các bộ phận: rễ, lá, hoa và vỏ hạt xanh.
Số liệu phân tích được minh họa qua biểu đồ hình 3.4 cho thấy: Mức độ biểu hiện của 7 GmMSRA trong các loại mơ khác nhau có khác biệt nhất định. Đáng chú ý là mức độ biểu hiện cao nhất của GmMSRA3 ở các mô từ bộ phận rễ cây (tế bào
lông hút, đầu mút, nốt sần) và của GmMSRA2, GmMSRA5 từ lá cây, trong khi các
GmMSRA khác lại cho thấy sự tương đồng về mức độ biểu hiện dù được phân lập từ
các mô khác nhau. Do đó, trong hướng nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi chọn tách dịng 2 gen tương ứng mã hóa cho GmMSRA3 (mức độ biểu hiện cao và có sự khác biệt rõ rệt giữa các mô khác nhau) và GmMSRA6 (mức độ biểu hiện thấp và có sự tương đồng giữa các mô khác nhau) và tiến hành siêu biểu hiện trên nấm men S.
cerevisiae để đánh giá tính chất của 2 gen này.
3.2.2. Đánh giá mức độ biểu hiện của các GmMSRA ở các giai đoạn phát triển khác nhau trên Genevestigator®
Hình 3.5. Mức độ biểu hiện của các GmMSRA ở các giai đoạn phát triển khác nhau
Kết quả phân tích cho thấy tùy thuộc giai đoạn phát triển của cây (nảy mầm → cây non → tăng trưởng mạnh → trưởng thành → thành thục: ra hoa, tạo quả) mà các GmMSRA có mức độ biểu hiện khác nhau nhằm đáp ứng nhu cầu sinh trưởng
của tế bào, trong đó GmMSRA1 và GmMSRA3 ln được duy trì ở mức độ biểu hiện cao trong suốt chu trình phát triển của cây. Điều đáng chú ý là khi cây bước vào giai đoạn tăng trưởng mạnh, vai trò của GmMSRA6 được tăng cường, mức độ biểu hiện gen tăng lên nhanh chóng và duy trì ở mức cao. Do đó, trong hướng nghiên cứu thực nghiệm, chúng tơi tiến hành tách dịng và siêu biểu hiện GmMSRA6 trên cây
3.2.3. Đánh giá mức độ biểu hiện của các GmMSRA trong điều kiện bình
thường và bất lợi
Hình 3.6. Mức độ biểu hiện của các GmMSRA trong điều kiện bình thường và điều kiện khô hạn (*)
*: Số liệu của Le và cs chưa được cơng bố
Để tìm hiểu vai trị của các gen mã hóa cho GmMSRA trong điều kiện hạn, chúng tơi tiến hành phân tích mức độ biểu hiện của các GmMSRA trong điều kiện
khô hạn (ngừng tưới nước 6 ngày liên tiếp), số liệu qPCR chúng tơi thu được cũng tương ứng với phân tích của Libaut và cs (hình 3.4). GmMSRA2 và GmMSRA5 theo thứ tự có mức độ biểu hiện cao nhất ở mơ lá trong điều kiện bình thường thì trong điều kiện khô hạn 2 gen này được tăng cường biểu hiện. Trong khi đó, GmMSRA1 và GmMSRA6 có mức độ biểu hiện rất thấp. Các GmMSRA cịn lại có đáp ứng phiên mã với điều kiện khô hạn (GmMSRA4 và GmMSRA7) hoặc không rõ ràng
(GmMSRA3). Kết quả này cho phép dự đốn GmMSRA2, GmMSRA4, GmMSRA5
và GmMSRA7 có thể có vai trị tăng cường sức đề kháng trên lá của đậu tương trong điều kiện khô hạn.
3.3. PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HÓA ENZYME GmMSRA CỦA ĐẬU TƯƠNG THÔNG QUA BIỂU HIỆN TRÊN NẤM MEN
SACCHAROMYCES CEREVISIAE.
3.3.1. Kết quả tách dòng gen
3.3.1.1. Nhân dòng cADN sử dụng kĩ thuật PCR
Để nhân dòng đoạn cADN mã hóa gen GmMSRA6 trong hệ gen đậu tương, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với gen đích. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,3%, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím ở bước sóng 245 nm. Kết quả điện di được minh họa trong hình 3.7.
Hình 3.7. Kết quả nhân dịng đoạn cADN mã hóa gen GmMSRA6 sử dụng phản ứng PCR sử dụng phản ứng PCR
Giếng 1: Thang chuẩn 1 kb; Giếng 2: đoạn ADN mã hóa GmMSRA6
Hình ảnh điện di khơng thấy xuất hiện băng phụ, chứng tỏ cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR đặc hiệu với gen đích, băng ADN thu được có kích thước mong đợi, sáng và rõ nét, đủ điều kiện để sử dụng trong thí nghiệm tiếp theo.
3.3.1.2. Chuyển gen GmMSRA6 vào vector pKS
Vector tách dòng pBluescript II KS (+/-) (pKS) sử dụng trong nghiên cứu có cấu trúc được minh họa trong hình 3.8.
Hình 3.8. Cấu trúc vector tách dịng pKS
Đoạn gen đích là sản phẩm PCR được tinh sạch bằng GeneAll® ExpinTM KIT,
vector tách dòng pKS đã được xử lý với enzyme giới hạn SmaI (NEB). Sử dụng
Quick Ligation TM KIT (NEB) để kết nối gen đích GmMSRA6 vào vector pKS. Dịng
vector tái tổ hợp pKS-GmMSRA6 được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Phương pháp sàng lọc thể biến nạp được sử dụng trong thí nghiệm này là sàng lọc xanh-trắng: Plasmid là pKS mang gen chọn lọc kháng ampicilin và gen β- galactosidase. Trong mơi trường có bổ sung X-Gal 50 mg/L (cơ chất nhân tạo của β-galactosidase) và chất cảm ứng IPTG 0,1 M thì các tế bào chứa plasmid mang gen mong muốn cho khuẩn lạc màu trắng, tế bào chứa plasmid không mang gen mong muốn cho khuẩn lạc màu xanh.
Tinh sạch plasmid pKS-GmMSRA6 từ dịch ni khuẩn lạc có màu trắng sử dụng GeneAll® ExprepTM KIT. Plasmid sau khi tinh sạch được xử lý đồng thời với 2
enzyme giới hạn SpeI và SalI (NEB). Trình tự nhận biết của 2 enzyme được minh
họa trong hình 3.9.
Hình 3.9. Vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn
Hình 3.10. Kết quả biến nạp gen GmMSRA6 vào vector pKS
Giếng 1: Thang chuẩn 1 kb; Giếng 2: Vector tái tổ hợp pKS-GmMSRA6 sau khi xử lý với SpeI và SalI
Kết quả điện di cho thấy, vector tái tổ hợp pKS-GmMSRA6 chứa trình tự nhận biết của 2 enzyme giới hạn SpeI và SalI, do đó sau phản ứng cắt trên bản điện di xuất hiện 2 băng: vector pKS và gen chuyển GmMSRA6. Hai băng ADN đều
sáng và rõ nét, đặc biệt băng GmMSRA6 thu được có kích thước mong đợi.
Plasmid pKS mang đoạn ADN mã hóa cho GmMSRA6 sau đó được giải trình tự và so sánh với trình tự đã được cơng bố trên ngân hàng gen đã khẳng định tính chính xác của kết quả tách dòng gen. Như vậy, plasmid tái tổ hợp pKS-GmMSRA6 thu được đạt độ tin cậy để tiến hành các thí nghiệm tiếp sau.
3.3.1.3. Chuyển gen vào vector đặc hiệu nấm men p425
Vector biểu hiện nấm men p425GPD sử dụng trong nghiên cứu có cấu trúc được minh họa trong hình 3.11.
Hình 3.11. Cấu trúc vector biểu hiện nấm men p425GPD [39]
Gen đích GmMSRA6 được cắt và tinh sạch từ vector tái tổ hợp pKS- GmMSRA6, sau đó được gắn kết vào vector biểu hiện nấm men p425 (đã được cắt với 2 enzyme giới hạn SpeI và SalI) sử dụng Quick Ligation TM KIT (NEB). Dòng
vector tái tổ hợp p425-GmMSRA6 được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và chọn lọc trên môi trường LB, có bổ sung ampicillin 50 mg/L.
Để kiểm tra dòng tế bào E. coli có mang vector tái tổ hợp, chúng tôi tiến
trường chọn lọc sử dụng GeneAll® ExprepTM KIT và xử lý plasmid này với 2
enzyme giới hạn SpeI và SalI. Sản phẩm của quá trình xử lý với enzyme cắt được
điện di kiểm tra đồng thời với đoạn gen GmMSRA6 đã được giải trình tự trên gel agarose 1,3%, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia UV ở bước sóng 245 nm. Kết quả được minh họa trong hình 3.12.
Hình 3.12. Kết quả biến nạp gen GmMSRA6 vào vector p425
Giếng 1: Thang chuẩn 1 kb; Giếng 2: Vector tái tổ hợp p425-GmMSRA6 sau khi xử lý với SpeI và SalI;
Giếng 3: Gen đích GmMSRA6 đã được giải trình tự
Kết quả điện di cho thấy, vector tái tổ hợp p425-GmMSRA6 chứa trình tự nhận biết của 2 enzyme giới hạn SpeI và SalI, sau phản ứng cắt trên bản điện di xuất hiện 2 băng: vector p425 và gen chuyển GmMSRA6. Hai băng ADN đều sáng và rõ nét, đặc biệt băng GmMSRA6 (sản phẩm cắt) thu được có kích thước mong đợi và
tương đương với kích thước của sản phẩm PCR đã được giải trình tự. Do đó, chúng tôi sử dụng plasmid tái tổ hợp p425-GmMSRA6 đã được tinh sạch từ tế bào E. coli cho các thử nghiệm tiếp theo.
3.3.2. Kết quả thử nghiệm in vivo hoạt tính xúc tác phản ứng chuyển hóa MetO thành Met của các GmMSRA. thành Met của các GmMSRA.
Biến nạp các dòng vector tái tổ hợp p425-MSRA (mang gen mã hóa các MSRA của đậu tương GmMSRA hoặc nấm men yMSRA) vào chủng nấm men đã bị bất hoạt đồng thời cả 3 gen mã hóa cho các MSR (yMSRA, yMSRB và yfRMSR), dưới sự điều khiển của promoter mạnh GPD và nuôi cấy đồng thời trên 2 môi trường chọn lọc: mơi trường khơng có L-Leu (hình 3.11 A) và mơi trường khơng có
L-Met, có L-MetO 20 mg/L (hình 3.11 B). Gen chọn lọc của plasmid p425 liên quan
đến quá trình sinh tổng hợp Leucine (Leu), do đó dịng tế bào nấm men mang plasmid p425 sẽ có khả năng sinh trưởng trên môi trường thiếu Leu. Đối với môi trường chọn lọc thiếu Met, có MetO thì chỉ những tế bào nấm men mang plasmid được biểu hiện gen mã hóa cho enzyme MSRA và gen được biểu hiện có khả năng chuyển hóa MetO thành Met mới khả năng tồn tại và phát triển. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được minh họa trong hình 3.13.
Như vậy, dưới sự điều khiển của promoter mạnh GPD, GmMSRA3
(p425GPD-A3) và yMSRA (p425GPD-yA và p425-yPRO-yA) đã hỗ trợ quá trình
sinh trưởng của các tế bào nấm men đột biến trên mơi trường chỉ có L-MetO là
nguồn cung cấp duy nhất của Met, trong khi GmMSRA6 khơng có hoạt tính bổ trợ này, chứng tỏ GmMSRA6 khơng có họat tính khử MetO in vivo. Kết quả thử
nghiệm này phản ánh những phân tích tin sinh học đã trình bày ở trên. Trong trình tự chuỗi polypeptide mã hóa cho GmMSRA6 tại vị trí Cys xúc tác được thay thế
bằng Ser, Cys tái tạo được thay thế bằng các axit amin khác (Hình 3.2), do đó tuy có chứa domain đặc trưng cho MSRA, có được sinh tổng hợp trong tế bào chất nhưng GmMSRA6 khơng có chức năng xúc tác chuyển hóa MetO thành Met. Vì
vậy, chủng nấm men mang vector siêu biểu hiện gen GmMSRA6 khơng thể sống sót và sinh trưởng trên mơi trường chỉ có L-MetO là nguồn cung cấp duy nhất của Met.
3.3.3. Kết quả đánh giá khả năng kháng lại tác nhân oxi hóa của các chủng nấm men mang vector biểu hiện gen mã hóa cho MSRA nấm men mang vector biểu hiện gen mã hóa cho MSRA
Trong thử nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ tế bào khi có tác nhân oxi hóa, các chủng nấm men đột biến được nuôi cấy trên mơi trường lỏng khơng có Leu, cho đến khi OD600 = 0,6 – 0,8, tác nhân oxi hóa H2O2 sẽ được bổ sung với nồng độ cuối cùng là 10 mM và xử lý trong thời gian 30 phút và 60 phút. Tế bào sau đó được rửa sạch, pha loãng 10-1 đến 10-4 lần, nhỏ trên môi trường thạch khơng có Leu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được minh họa trong hình 3.14.
Hình 3.14. Thử nghiệm khả năng kháng lại tác nhân oxi hóa H2O2
Kết quả thử nghiệm cho thấy: Biểu hiện đáp ứng với H2O2 của chủng nấm men mang vector siêu biểu hiện GmMSRA3 (∆3MSR, p425GPD-GmMSRA3) trong
điều kiện thí nghiệm này là khơng có sự khác biệt so với 3 chủng đối chứng (∆3MSR, p425GPD-yA, ∆3MSR, p425 yPRO-yA, ∆3MSR, p425GPD). Trong khi
đó, chủng nấm men mang vector siêu biểu hiện GmMSRA6 (∆3MSR, p425GPD- GmMSRA6) lại nhạy cảm với H2O2 hơn so với chủng ∆3MSR, p425GPD- GmMSRA3 và 3 chủng đối chứng. Hiện tượng này có thể được giải thích như sau:
trong điều kiện tất cả các MSR bị bất hoạt, siêu biểu hiện GmMSRA6 làm tăng
cường mức độ sinh tổng hợp enzyme GmMSRA6 trong tế bào, enzyme này tương tác với cơ chất (là các phân tử protein có Met bị oxi hóa thành MetO), nhưng do enzyme này khơng có hoạt tính sửa chữa nên việc MSRA6 bám trên các protein lại trở thành yếu tố kìm hãm hoạt động của các protein (các protein này vẫn có thể thực hiện một phần chức năng sinh học dù có chứa Met bị oxi hóa). Như vậy, tăng cường biểu hiện GmMSRA6 làm gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào với tác nhân oxi hóa H2O2, do đó các giảm khả năng sinh trưởng của tế bào nấm men trong điều kiện môi trường bất lợi.
3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HĨA ENZYME GmMSRA THÔNG QUA BIỂU HIỆN TRÊN CÂY MƠ HÌNH GmMSRA THƠNG QUA BIỂU HIỆN TRÊN CÂY MÔ HÌNH
ARABIDOPSIS THALIANA
3.4.1. Kết quả tạo cây mơ hình A. thaliana siêu biểu hiện gen mã hóa cho enzyme MSR bằng phương pháp nhúng hoa.
Vector chuyển gen pGreen sử dụng trong nghiên cứu có cấu trúc được minh họa trong hình 3.15.
Vector pGreen mang cấu trúc 35S::MSRA6 sau khi được biến nạp vào vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã tiếp tục được biến nạp vào cây mơ hình A. thaliana sử dụng kĩ thuật nhúng hoa (Clough and Bent, 1998). Bằng phương pháp
này, chúng tôi đã biến nạp thành công GmMSRA6 dưới sự điều khiển của promoter 35S vào cây mơ hình Arabidopsis thaliana kiểu dại (Col-0). Cây chuyển gen mang gen chỉ thị kháng kháng sinh kanamycin do đó có khả năng nảy mầm và sống sót trên mơi trường chọn lọc (1/2 MS, kan 30 mg/l), trong khi cây không mang gen chuyển nảy mầm và sau đó chết trắng trên mơi trường chọn lọc. Kết quả tạo cây mơ hình siêu biểu hiện GmMSRA6 được minh họa trong hình 3.16.
Hình 3.16. Tạo cây chuyển gen bằng phương pháp nhúng hoa và chọn lọc trên mơi trường ½ MS, kanamycin 30 mg/L.