Nhiệt độ Thời gian Số chu kì
95ºC 1 phút 1 95ºC 30 giây 35 54ºC 30 giây 68ºC 45 giây 68ºC 5 phút 1 4ºC ∞
2.2.4.2. Phân tích kiểu hình cây chuyển gen
Trồng cây chuyển gen trên giá thể đất và thu hạt đến thế hệ F3. Xác định cây ‘single-copy’ và đồng hợp tử ở thế hệ F3 thơng qua hệ số phân li kiểu hình và kiểu gen theo Mendel trên mơi trường ½ MS có và khơng có kháng sinh kanamycin.
2.2.4.3. Đánh giá hình thái cây chuyển gen
− Gieo hạt chuyển gen và hạt đối chứng trên mơi trường ½ MS, bổ sung kanamycin. Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch MS ở các giai đoạn khác nhau.
− Chọn các cây 10 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên mơi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất. Quan sát sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất ở tuần tuổi khác nhau.
2.2.4.4. Thử nghiệm tính kháng mặn
Gieo hạt cây chuyển gen và cây đối chứng trên môi trường MS. Chuyển cây 10 ngày tuổi sang mơi trường ½ MS, kanamycin, có bổ sung NaCl ở nồng độ 200 mM. Cây sống sót trên mơi trường có bổ sung NaCl sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ TÌM KIẾM VÀ PHÂN TÍCH CÁC GEN MÃ HĨA CHO ENZYME MSRA TRONG HỆ GEN ĐẬU TƯƠNG
Để bắt đầu phân tích, chúng tơi tiến hành tìm kiếm trình tự các peptide mã hóa cho enzyme MSRA trong hệ gen của cây đậu tương (GmMSRA) sử dụng cơ sở dữ liệu PHYTOZOME (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html). Với trình tự mẫu là gen mã hóa cho MSRA đã biết của cây mơ hình Arabidopsis thaliana, chúng tơi đã xác định được 7 trình tự GmMSRA (bảng 3.1).
Trước khi sử dụng các trình tự GmMSRA tìm kiếm được trong PHYTOZOME cho những phân tích tiếp theo, chúng tôi sử dụng cơ sở dữ liệu
PFAM (http://pfam.xfam.org/) nhằm kiểm tra các trình tự này có thực sự mã hóa
cho enzyme MSRA hay khơng? PFAM sẽ xác định trình tự đưa vào có mang cấu trúc domain đặc trưng cho hoạt tính xúc tác của protein MSRA và kết quả phân tích được thể hiện qua giá trị kỳ vọng E value, giá trị này càng thấp thì độ tin cậy càng cao. Kết quả kiểm tra thể hiện trong bảng 3.1 cho thấy giá trị E value của tất cả các
GmsMSRA đều ở mức rất thấp, như vậy 7 trình tự GmMSRA tìm kiếm được là chính
xác và đủ tin cậy để sử dụng trong các phân tích tiếp theo.
Bảng 3.1. Xác định domain đặc trưng và dự đốn vị trí trong tế bào của các protein MSRA
Tên gen Mã định dạng gen Chiều dài
protein E values
A.a.
xúc tác cTP mTP SP Other Vị
trí RC Tplen
GmMSRA1 Glyma02g05550 250 1,70E-46 0,008 0,177 0,758 0,234 S 3 28
GmMSRA2 Glyma02g46020 266 4,00E-63 Cys 108 0,972 0,012 0,029 0,025 C 1 77
GmMSRA3 Glyma04g36480 194 4,80E-58 Cys 36 0,127 0,109 0,14 0,909 − 2 −
GmMSRA4 Glyma08g42790 203 1,20E-60 Cys 45 0,117 0,313 0,032 0,515 − 4 −
GmMSRA5 Glyma14g02705 266 3,00E-63 Cys 108 0,964 0,015 0,017 0,02 C 1 77
GmMSRA6 Glyma16g24130 250 3,00E-46 0,006 0,086 0,924 0,048 S 1 28
GmMSRA7 Glyma18g11110 203 2,00E-60 Cys 45 0,109 0,472 0,023 0,356 M 5 56
E value: giá trị kì vọng
A.a. xúc tác: dự đoán axit amin nằm trong trung tâm hoạt động cTP (chloroplast transit peptide): tín hiệu protein được tiết ra lục lạp mTP (mitochondrial transit peptide): tín hiệu protein được tiết ra ty thể Other: tín hiệu protein có thể được tiết ra ngoại bào
SP (signal peptide): có tín hiệu tiết protein nhưng khơng xác định được vị trí đích RC = Reliability class (Độ tin cậy của dự đoán từ 1 – 5, mức 1 là mức tin cậy cao nhất) Tplen (Transit peptide length): chiều dài trình tự peptide tín hiệu
Một số protein ở sinh vật nhân chuẩn được phiên mã từ gen tương ứng trong nhân tế bào và tổng hợp trong tế bào chất và sau đó có thể được vận chuyển đến một bào quan nào đó (lục lạp, ty thể) để thực hiện chức năng. Trình tự các axit amin đầu N (N-terminal) trong chuỗi polypeptide, gọi là transit peptide (peptide tín hiệu) sẽ quyết định vị trí bào quan protein được tiết ra. Với trình tự axit amin của protein, sử dụng công cụ TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) cho phép nhận biết đích đến của protein với tỷ lệ thành công khoảng 85% ở thực vật và 90% ở nhóm sinh vật khác [17]. Sử dụng dữ liệu đầu vào (input) là trình tự chuỗi polypeptide của các GmMSRA từ cơ sở dữ liệu PHYTOZOME, TargetP sẽ thực
hiện các tính tốn cần thiết và trả lại dữ liệu đầu ra là các giá trị score (output) được trình bày trong bảng 3.1, dựa vào các score tương ứng chúng tơi có thể dự đốn bào quan đích mà các protein MSRA được vận chuyển đến. Số liệu thu được cho thấy:
GmMSRA2 và GmMSRA5 có giá trị score cao nhất ở cTP, tương ứng là 0,972 và
0,964, với độ tin cậy ở mức cao nhất. Như vậy, khả năng cao 2 protein này được tiết
ra lục lạp và chiều dài đoạn peptide tín hiệu của chúng là 77 axit amin đầu tiên trong chuỗi peptide. GmMSRA7 được dự đoán tiết ra ty thể và chiều dài đoạn
peptide tín hiệu là 56 axit amin, tuy nhiên protein này có giá trị score cao nhất ở mức trung bình 0,472 với độ tin cậy ở mức thấp nhất, do đó khó có thể khẳng định
GmMSRA7 có hay khơng thực hiện chức năng xúc tác của nó ở ty thể. GmMSRA1
và GmMSRA6 có tín hiệu tiết protein nhưng khơng xác định được vị trí đích, chúng có cùng chiều dài đoạn peptide tín hiệu là 28 axit amin, đáng chú ý là chỉ số score của GmMSRA6 ở SP rất cao 0,924 với độ tin cậy 1, trong khi chỉ số score của
GmMSRA1 là 0,758 với độ tin cậy 3. GmMSRA3 và GmMSRA4 là hai protein không
xác định được chiều dài đoạn peptide tín hiệu, chỉ số score và độ tin cậy cho thấy nhiều khả năng chúng được thực thi chức năng ở tế bào chất (cytosol).
Sử dụng cơng cụ BIOEDIT so sánh trình tự peptide của 7 GmMSRA, chúng
tôi xác định được vị trí vùng trình tự axit amin bảo thủ GCFWG tại đầu N của
protein, từ đó đưa ra dự đốn các Cys nằm trong trung tâm hoạt động của MSRA, quyết định hoạt tính xúc tác của enzyme (Cys xúc tác – Cys A) và các Cys tái tạo hoạt động của Cys A (Cys B và Cys C).
Hình 3.1. So sánh đa trình tự các protein GmMSRA
Kết quả được minh họa trong hình 3.1 chỉ ra rằng có 5 GmMSRA dự đốn có chứa các Cys xúc tác và Cys tái tạo, trong khi GmMSRA1 và GmMSRA6 tại các vị trí này Cys xúc tác được thay thế bằng Ser, Cys tái tạo được thay thế bằng các axit amin khác. Kết hợp với phân tích dự đốn trong bảng 3.1, chúng tôi đưa ra giả thuyết protein GmMSRA1 và GmMSRA6 tuy có chứa domain đặc trưng cho MSRA,
có được sinh tổng hợp trong tế bào chất nhưng hai protein này có thể khơng thực hiện chức năng xúc tác. Vị trí các Cys xúc tác và Cys tái tạo của các GmMSRA được tóm tắt trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Dự đốn vị trí Cys xúc tác và Cys tái tạo của các GmMSRA Tên gen Trình tự bảo thủ Cys xúc tác Cys tái tạo
GmMSRA2 Gly107 Cys108 Phe109 Trp110 Cys108 Cys143, Cys258, Cys264
GmMSRA3 Gly35 Cys36 Phe37 Trp38 Cys36 Cys71, Cys186, Cys192
GmMSRA4 Gly44 Cys45 Phe46 Trp47 Cys45 Cys99, Cys195, Cys201
GmMSRA5 Gly107 Cys108 Phe109 Trp110 Cys108 Cys143, Cys258, Cys264
GmMSRA7 Gly44 Cys45 Phe46 Trp47 Cys45 Cys99, Cys195, Cys201
Sử dụng trình tự ADN genome và trình tự ADN mã hóa (Coding DNA sequence) từ cơ sở dữ liệu PHYTOZOME kết hợp với công cụ “Gene Structure
Display Server” (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php) chúng tôi biểu diễn số lượng exon – intron của các gen mã hóa cho GmMSRA trên hình 3.2
Cấu trúc các gen mã hóa cho GmMSRA đều có sự xen kẽ giữa các đoạn exon và intron, đa số gen gồm hai exon (5/7 gen) xen kẽ một intron (4/7 gen), riêng
GmMSRA1 và GmMSRA6 có số lượng exon và intron lớn nhất (4 exon, 3 intron).
Đoạn intron thường có kích thước lớn gấp nhiều lần so với các đoạn exon. Ở
GmMSRA2, GmMSRA4 và GmMSRA7 xuất hiện đoạn exon có kích thước khá lớn
so với các đoạn exon khác thuộc cùng một gen hoặc giữa 2 gen khác nhau. Số lượng exon và intron của các GmMSRA được thống kê trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Số lượng exon và intron của các GmMSRA
Tên gen Kích thước (bp) Số lượng
ADN genome ADN mã hóa Exon Intron
GmMSRA1 5049 753 4 2 GmMSRA2 2758 801 2 1 GmMSRA3 2246 585 2 1 GmMSRA4 4104 612 2 1 GmMSRA5 2463 801 2 1 GmMSRA6 4765 753 4 2 GmMSRA7 3188 804 2 2
Từ kết quả những phân tích trình bày ở trên, chúng tôi nhận thấy 3 cặp
GmMSRA có sự tương đồng khá cao trong trình tự chuỗi polipeptide, đó là GmMSRA1 và GmMSRA6, GmMSRA2 và GmMSRA5, GmMSRA4 và GmMSRA7,
rất có khả năng các gen này được hình thành do hiện tượng nhân đôi hệ gen (genome duplication). Sử dụng cơ sở dữ liệu chibba.agtec.uga.edu/duplication/,
với kết quả phân tích có được, dựa trên số lượng locus gen tương đồng được tìm thấy trên các nhiễm sắc thể (NST) chúng tơi có thể kiểm chứng giả thiết đặt ra ở trên (hình 3.3)
Hình 3.3. Các GmMSRA được hình thành do nhân đơi hệ gen
Trên NST số 2 (chứa locus gen mã hóa cho GmMSRA2) và NST số 14 (chứa locus gen mã hóa cho GmMSRA5) tìm thấy số lượng rất lớn vị trí các locus gen
tương đồng, chúng tôi dự đoán khả năng cao 2 GmMSRA này là gen lặp lại của
nhau. Đối với GmMSRA1 (NST số 2) và GmMSRA6 (NST số 16), GmMSRA4 (NST số 8) và GmMSRA7 (NST số 18) cũng ghi nhận nhiều vị trí locus gen tương đồng
nhưng với kết quả này chúng tôi chưa thể khẳng định một cách chắc chắn 2 cặp
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN MÃ HÓA MSRA TRONG HỆ GEN ĐẬU TƯƠNG HÓA MSRA TRONG HỆ GEN ĐẬU TƯƠNG
3.2.1. Đánh giá mức độ biểu hiện của các GmMSRA ở các mô khác nhau
Sử dụng cơ sở dữ liệu của Libault và cs (2010) cho phép đánh giá mức độ biểu hiện của 7 gen mã hóa cho GmMSRA ở hệ gen đậu tương trong 9 loại mô khác nhau bao gồm: Mô tế bào lông hút được phân lập sau 84 giờ và sau 120 giờ gieo hạt, mô tế bào đầu mút rễ, nốt sần, mô phân sinh đỉnh chồi, các bộ phận: rễ, lá, hoa và vỏ hạt xanh.
Số liệu phân tích được minh họa qua biểu đồ hình 3.4 cho thấy: Mức độ biểu hiện của 7 GmMSRA trong các loại mơ khác nhau có khác biệt nhất định. Đáng chú ý là mức độ biểu hiện cao nhất của GmMSRA3 ở các mô từ bộ phận rễ cây (tế bào
lông hút, đầu mút, nốt sần) và của GmMSRA2, GmMSRA5 từ lá cây, trong khi các
GmMSRA khác lại cho thấy sự tương đồng về mức độ biểu hiện dù được phân lập từ
các mô khác nhau. Do đó, trong hướng nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi chọn tách dịng 2 gen tương ứng mã hóa cho GmMSRA3 (mức độ biểu hiện cao và có sự khác biệt rõ rệt giữa các mô khác nhau) và GmMSRA6 (mức độ biểu hiện thấp và có sự tương đồng giữa các mô khác nhau) và tiến hành siêu biểu hiện trên nấm men S.
cerevisiae để đánh giá tính chất của 2 gen này.
3.2.2. Đánh giá mức độ biểu hiện của các GmMSRA ở các giai đoạn phát triển khác nhau trên Genevestigator®
Hình 3.5. Mức độ biểu hiện của các GmMSRA ở các giai đoạn phát triển khác nhau
Kết quả phân tích cho thấy tùy thuộc giai đoạn phát triển của cây (nảy mầm → cây non → tăng trưởng mạnh → trưởng thành → thành thục: ra hoa, tạo quả) mà các GmMSRA có mức độ biểu hiện khác nhau nhằm đáp ứng nhu cầu sinh trưởng
của tế bào, trong đó GmMSRA1 và GmMSRA3 ln được duy trì ở mức độ biểu hiện cao trong suốt chu trình phát triển của cây. Điều đáng chú ý là khi cây bước vào giai đoạn tăng trưởng mạnh, vai trò của GmMSRA6 được tăng cường, mức độ biểu hiện gen tăng lên nhanh chóng và duy trì ở mức cao. Do đó, trong hướng nghiên cứu thực nghiệm, chúng tơi tiến hành tách dịng và siêu biểu hiện GmMSRA6 trên cây
3.2.3. Đánh giá mức độ biểu hiện của các GmMSRA trong điều kiện bình
thường và bất lợi
Hình 3.6. Mức độ biểu hiện của các GmMSRA trong điều kiện bình thường và điều kiện khơ hạn (*)
*: Số liệu của Le và cs chưa được công bố
Để tìm hiểu vai trị của các gen mã hóa cho GmMSRA trong điều kiện hạn, chúng tơi tiến hành phân tích mức độ biểu hiện của các GmMSRA trong điều kiện
khô hạn (ngừng tưới nước 6 ngày liên tiếp), số liệu qPCR chúng tôi thu được cũng tương ứng với phân tích của Libaut và cs (hình 3.4). GmMSRA2 và GmMSRA5 theo thứ tự có mức độ biểu hiện cao nhất ở mô lá trong điều kiện bình thường thì trong điều kiện khơ hạn 2 gen này được tăng cường biểu hiện. Trong khi đó, GmMSRA1 và GmMSRA6 có mức độ biểu hiện rất thấp. Các GmMSRA cịn lại có đáp ứng phiên mã với điều kiện khô hạn (GmMSRA4 và GmMSRA7) hoặc không rõ ràng
(GmMSRA3). Kết quả này cho phép dự đoán GmMSRA2, GmMSRA4, GmMSRA5
và GmMSRA7 có thể có vai trị tăng cường sức đề kháng trên lá của đậu tương trong điều kiện khô hạn.
3.3. PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HÓA ENZYME GmMSRA CỦA ĐẬU TƯƠNG THÔNG QUA BIỂU HIỆN TRÊN NẤM MEN
SACCHAROMYCES CEREVISIAE.
3.3.1. Kết quả tách dòng gen
3.3.1.1. Nhân dòng cADN sử dụng kĩ thuật PCR
Để nhân dịng đoạn cADN mã hóa gen GmMSRA6 trong hệ gen đậu tương, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với gen đích. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,3%, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím ở bước sóng 245 nm. Kết quả điện di được minh họa trong hình 3.7.
Hình 3.7. Kết quả nhân dịng đoạn cADN mã hóa gen GmMSRA6 sử dụng phản ứng PCR sử dụng phản ứng PCR
Giếng 1: Thang chuẩn 1 kb; Giếng 2: đoạn ADN mã hóa GmMSRA6
Hình ảnh điện di khơng thấy xuất hiện băng phụ, chứng tỏ cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR đặc hiệu với gen đích, băng ADN thu được có kích thước mong đợi, sáng và rõ nét, đủ điều kiện để sử dụng trong thí nghiệm tiếp theo.
3.3.1.2. Chuyển gen GmMSRA6 vào vector pKS
Vector tách dòng pBluescript II KS (+/-) (pKS) sử dụng trong nghiên cứu có cấu trúc được minh họa trong hình 3.8.
Hình 3.8. Cấu trúc vector tách dòng pKS
Đoạn gen đích là sản phẩm PCR được tinh sạch bằng GeneAll® ExpinTM KIT,
vector tách dòng pKS đã được xử lý với enzyme giới hạn SmaI (NEB). Sử dụng
Quick Ligation TM KIT (NEB) để kết nối gen đích GmMSRA6 vào vector pKS. Dịng
vector tái tổ hợp pKS-GmMSRA6 được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Phương pháp sàng lọc thể biến nạp được sử dụng trong thí nghiệm này là sàng lọc xanh-trắng: Plasmid là pKS mang gen chọn lọc kháng ampicilin và gen β- galactosidase. Trong mơi trường có bổ sung X-Gal 50 mg/L (cơ chất nhân tạo của β-galactosidase) và chất cảm ứng IPTG 0,1 M thì các tế bào chứa plasmid mang gen mong muốn cho khuẩn lạc màu trắng, tế bào chứa plasmid không mang gen mong muốn cho khuẩn lạc màu xanh.
Tinh sạch plasmid pKS-GmMSRA6 từ dịch ni khuẩn lạc có màu trắng sử dụng GeneAll® ExprepTM KIT. Plasmid sau khi tinh sạch được xử lý đồng thời với 2
enzyme giới hạn SpeI và SalI (NEB). Trình tự nhận biết của 2 enzyme được minh
họa trong hình 3.9.
Hình 3.9. Vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn
Hình 3.10. Kết quả biến nạp gen GmMSRA6 vào vector pKS
Giếng 1: Thang chuẩn 1 kb; Giếng 2: Vector tái tổ hợp pKS-GmMSRA6 sau khi xử lý với SpeI và SalI
Kết quả điện di cho thấy, vector tái tổ hợp pKS-GmMSRA6 chứa trình tự nhận biết của 2 enzyme giới hạn SpeI và SalI, do đó sau phản ứng cắt trên bản điện di xuất hiện 2 băng: vector pKS và gen chuyển GmMSRA6. Hai băng ADN đều
sáng và rõ nét, đặc biệt băng GmMSRA6 thu được có kích thước mong đợi.
Plasmid pKS mang đoạn ADN mã hóa cho GmMSRA6 sau đó được giải trình tự và so sánh với trình tự đã được cơng bố trên ngân hàng gen đã khẳng định tính