Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HĨA ENZYME GmMSRA CỦA ĐẬU
3.3.2. Kết quả thử nghiệm in vivo hoạt tính xúc tác phản ứng chuyển hóa MetO
thành Met của các GmMSRA.
Biến nạp các dòng vector tái tổ hợp p425-MSRA (mang gen mã hóa các MSRA của đậu tương GmMSRA hoặc nấm men yMSRA) vào chủng nấm men đã bị bất hoạt đồng thời cả 3 gen mã hóa cho các MSR (yMSRA, yMSRB và yfRMSR), dưới sự điều khiển của promoter mạnh GPD và nuôi cấy đồng thời trên 2 mơi trường chọn lọc: mơi trường khơng có L-Leu (hình 3.11 A) và mơi trường khơng có
L-Met, có L-MetO 20 mg/L (hình 3.11 B). Gen chọn lọc của plasmid p425 liên quan
đến quá trình sinh tổng hợp Leucine (Leu), do đó dịng tế bào nấm men mang plasmid p425 sẽ có khả năng sinh trưởng trên môi trường thiếu Leu. Đối với môi trường chọn lọc thiếu Met, có MetO thì chỉ những tế bào nấm men mang plasmid được biểu hiện gen mã hóa cho enzyme MSRA và gen được biểu hiện có khả năng chuyển hóa MetO thành Met mới khả năng tồn tại và phát triển. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được minh họa trong hình 3.13.
Như vậy, dưới sự điều khiển của promoter mạnh GPD, GmMSRA3
(p425GPD-A3) và yMSRA (p425GPD-yA và p425-yPRO-yA) đã hỗ trợ quá trình
sinh trưởng của các tế bào nấm men đột biến trên môi trường chỉ có L-MetO là
nguồn cung cấp duy nhất của Met, trong khi GmMSRA6 khơng có hoạt tính bổ trợ này, chứng tỏ GmMSRA6 không có họat tính khử MetO in vivo. Kết quả thử
nghiệm này phản ánh những phân tích tin sinh học đã trình bày ở trên. Trong trình tự chuỗi polypeptide mã hóa cho GmMSRA6 tại vị trí Cys xúc tác được thay thế
bằng Ser, Cys tái tạo được thay thế bằng các axit amin khác (Hình 3.2), do đó tuy có chứa domain đặc trưng cho MSRA, có được sinh tổng hợp trong tế bào chất nhưng GmMSRA6 khơng có chức năng xúc tác chuyển hóa MetO thành Met. Vì
vậy, chủng nấm men mang vector siêu biểu hiện gen GmMSRA6 khơng thể sống sót và sinh trưởng trên mơi trường chỉ có L-MetO là nguồn cung cấp duy nhất của Met.