CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng Lactobacillus spp trong
mẫu sữa mẹ
2.2.1.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp. trong mẫu sữa mẹ
Xác định tổng số Lactobacilli (CFU/mL) xuất hiện trong mỗi mẫu sữa theo phương pháp của Sinkiewicz và Ljunggren (2008): mỗi mẫu sữa được pha loãng 10 lần trong dung dịch NaCl 0,15 M. Sau đó cấy trải 100 µL mẫu từ mỗi nồng độ pha lỗng lên trên đĩa thạch MRS và đĩa thạch LBS. Các đĩa thạch này sau đó được ủ trong 48 - 72 giờ ở 37oC dưới điều kiện kị khí [91]. Thành phần mơi trường MRS và LBS được liệt kê dưới đây:
- Môi trường thạch MRS
Thành phần Khối lượng hoặc thể tích
Đường 20 g/L Pepton 10 g/L Cao nấm men 5 g/L Cao thịt 5 g/L K2HPO4.3H3O 2 g/L Tween 80 1 mL/L MgSO4.7H2O 0,2 g/L MnSO4 0,05 g/L CH3COONa 5 g/L CaCO3 10 g/L Agar 15 g/L H2O 1 lít
- Mơi trường MRS lỏng khơng có CaCO3 và agar.
Chuẩn pH 6,2 – 6,5. Khử trùng ướt môi trường 110oC trong 20 phút.
- Mơi trường LBS
Thành phần Khối lượng/Thể tích (gam/lít)
Casein enzymic hydrolysate 10,0
Yeast extract 5,0
Dextrose 20,0
Sodium acetate 25,0 Monopotassium hydrogen phosphate 6,0
Ammonium citrate 2,0 Polysorbate 80 1,0 Magnesium sulphate 0,575 Manganese sulphate 0,12 Ferrous sulphate 0,034 Agar 15,0
Chuẩn pH 5.5 ± 0.2 (ở 25 oC). Khử trùng ướt môi trường 121oC trong 15 phút. Làm giàu môi trường để tăng sinh L. reuteri trong các mẫu sữa mẹ theo phương pháp của Sinkiewicz và Ljunggren (2008): Cứ 1 mL sữa mẹ đã voltex đều được thêm vào 10 mL môi trường (bao gồm 20 mM arabinose; 20 mM ribose; 1 mM MgSO4; 0,1 mM MnSO4; 5 mM FeSO4). Hỗn hợp làm giàu được ủ ở 37oC trong 6 đến 8 giờ. Các mẫu sữa mẹ sau khi làm giàu được cấy trải trên môi trường thạch MRS cải tiến chứa 0,05 mg/mL vancomycin để xác định sự có mặt của L. reuteri. Các đĩa thạch được ủ trong 48 - 72 giờ ở 37oC trong điều kiện kị khí [91]. Các khuẩn lạc L. reuteri được xác định và đếm bằng cách sử dụng phương pháp của Chung và đồng tác giả (1989) dựa trên việc sản xuất reuterin đặc trưng của L. reuteri từ glycerol trong điều kiện kị khí tại 37oC và pH 6-8 [24].
Các chủng Lactobacillus spp. sau phân lập được thử hoạt tính sơ bộ về khả năng sinh axit lactic và sau đó tuyển chọn ra các chủng có khả năng sinh axit lactic cao nhất để nghiên cứu sâu hơn, định danh bằng phân tích PCR và đặt tên chủng tuyển chọn.
2.2.1.2. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử
Khuẩn lạc riêng rẽ của các chủng được tuyển chọn được sử dụng để tách chiết ADN bằng Kit Anapure Bacterial DNA mini kit theo các bước sau:
- Thêm 150 L dịch chứa mẫu vi khuẩn vào ống eppendorf 1,5 mL vơ trùng sau đó thêm vào 20 µL Proteinase K.
- Thêm 250 L Binding Buffer. Trộn đều bằng cách pipet lên xuống 10 lần hoặc vortex 10-15 giây. Ủ mẫu ở 70oC trong 15 phút.
- Thêm 150 L Ethanol 96o. Vortex mẫu 10-15 giây hoặc pipet lên xuống 3-5 lần. - Chuyển mẫu ở bước 3 sang cột lọc SC01 (ANAPURE filter spin column) đặt trên ống thu dịch CT01 (ANAPURE collection tube).
- Ly tâm cột lọc-ống thu dịch SC01-CT01 ở tốc độ tối đa 12 000 vòng/phút trong 1 phút. Đổ bỏ dịch chảy qua cột.
- Thêm 500 L Washing Buffer 1 vào cột lọc SC01. Lặp lại bước 5.
- Thêm 500 L Washing Buffer 2 vào cột lọc SC01. Ly tâm cột lọc-ống thu dịch SC01-CT01 ở tốc độ tối đa 12000 vòng/phút trong 2 phút. Chú ý cần loại bỏ hồn tồn WB2 vì WB2 ảnh hưởng tới việc chiết đẩy ADN.
- Nhấc cột lọc SC01 chuyển sang ống thu mẫu eppendorf 1,5 mL vô trùng mới. - Thêm 50-200 L Elution Buffer vào trung tâm của cột lọc SC01. Ly tâm cột lọc ống eppendorf ở tốc độ tối đa 12000 vòng/phút trong 1 phút.
- Thu dịch chảy qua cột chứa ADN trong ống eppendorf. Bảo quản sản phẩm ADN tinh sạch ở -20oC hoặc sử dụng ngay cho ứng dụng mong muốn.
ADN tinh sạch được phân tích kích thước và độ tinh sạch bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% (100V - 30 phút), nhuộm bởi EtBr và được quan sát dưới ánh sáng UV. ADN sau tinh sạch được dùng làm khuôn của PCR khuếch đại đoạn gen mã hoá cho 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu 27F: 5’- AGAGTTTGATAMTGGCTCAG-3’ và 1527R: 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC- 3’ và chu trình nhiệt 95°C/10 phút - 30 chu kỳ 94°C/30 giây + 60°C/30 giây + 72°C/1 phút 30 giây - 72°C/5 phút - 4°C/∞. Thành phần của mỗi phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA được liệt kê dưới đây:
Thành phần Thể tích cho mỗi phản ứng (µL)
Nước cất 15,75
dNTP mix 2,5
10x Buffer 2,5
Forward primer (27F – 10 pmol) 1,0 Reverse primer (1527R – 10 pmol) 1,0 Enzyme mix (Taq polymerase) 0,25
ADN 2,0
Tổng thể tích 25
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1%, nhuộm EtBr và được quan sát dưới ánh sáng UV để kiểm tra kết quả. Sản phẩm PCR dương tính được tinh sạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất sử dụng Anapure PCR purification mini kit (ANABIO R&D). Sản phẩm PCR sau tinh sạch được điện di kiểm tra bằng gel agarose 1%, nhuộm bởi EtBr và quan sát dưới ánh sáng UV. Băng có kích thước khoảng 1500 base pair được gửi đi 1st BASE DNA Sequencing Services để giải trình
và so sánh với dữ liệu có sẵn trong ngân hàng gen của NCBI (GenBank) sử dụng chương trình BLAST nhằm tìm ra chủng có trình tự gần nhất với tỉ lệ tương đồng. Tên chủng vi khuẩn được đặt tên, định danh dựa vào kết quả BLAST. Các dữ liệu liên quan được trích xuất ở dạng FASTA để phục vụ cho phân tích phát sinh chủng loại.