CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tỉ lệ Lactobacillus spp và L reuteri ở khu vực nông thôn và khu vực thành
3.1.2. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp từ sữa
Từ 7 mẫu sữa mẹ có sự xuất hiện của L. reuteri đã phân lập được 8 chủng thuộc loài L. reuteri, 8 chủng này được đặt tên SMH2, SMH3, SMH4, SMH5, SMH6, SMH7, SMH8, SMH9.
Từ 25 mẫu có sự xuất hiện của các chủng Lactobacillus spp. đã phân lập được 27 chủng Lactobacillus spp. Các chủng này được đặt tên SMH1 và lần lượt từ SMH10 đến SM35.
Lactobacilli đã được chứng minh là ức chế sự tăng trưởng in-vitro của các vi sinh vật gây bệnh ở âm đạo như Bacteroides fragilis, E. coli, G. vaginalis,
Mobiluncus spp., Neisseria gonorrhoeae, Peptostreptococcus anaerobius, P. bivia, Staphylococcus aureus và Candida. Điều này đạt được chủ yếu thông qua hoạt động
của axit lactic [45], [61], [92], [94]. Hơn nữa, đây là các chủng vi khuẩn gây bệnh nên chúng tôi không thể nuôi cấy trực tiếp để nghiên cứu về khả năng ức chế các chủng này trong điều kiện phịng thí nghiệm hiện có. Do đó chúng tơi lựa chọn thử hoạt tính sơ bộ về khả năng sinh axit lactic để tuyển chọn ra chủng Lactobacillus
spp. với mục đích đưa chủng tuyển chọn định hướng vào sản xuất thực phẩm chức năng dành cho phụ nữ. Kết quả sinh axit lactic của 8 chủng L. reuteri và 27 chủng
Lactobacillus spp. được biểu diễn tại Bảng 3.
Bảng 3. Lượng axit lactic sinh ra của các chủng L. reuteri và Lactobacillus spp.
(Các giá trị trong Bảng 3 là giá trị trung bình sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, giá trị độ lệch chuẩn được thống kê tại Phụ lục 2)
STT
Ký hiệu các chủng thuộc loài L. reuteri
Lượng axit lactic (g/100 mL) 0 giờ 5 giờ 8 giờ 12 giờ 24
giờ 28 giờ 32 giờ 36 giờ 1 SMH2 0,03 0,321 0,333 0,372 0,765 1,192 1,396 1,227 2 SMH3 0,03 0,312 0,324 0,429 1,161 1,182 1,218 1,133 3 SMH4 0,03 0,285 0,288 0,321 0,422 0,552 0,396 0,320 4 SMH5 0,03 0,270 0,274 0,336 0,762 0,597 0,474 0,430 5 SMH6 0,03 0,240 0,258 0,330 0,670 0,587 0,435 0,432 6 SMH7 0,03 0,231 0,237 0,325 0,460 0,577 0,440 0,421 7 SMH8 0,03 0,250 0,264 0,268 0,410 0,597 0,472 0,413 8 SMH9 0,03 0,211 0,252 0,323 0,560 0,497 0,414 0,230
STT
Ký hiệu các chủng
Lactobacillus
spp.
Lượng axit lactic (g/100 mL) 0 giờ 5 giờ 8 giờ 12 giờ 24
giờ 28 giờ 32 giờ 36 giờ 9 SMH1 0,03 0,303 0,351 0,384 1,014 1,181 1,287 1,210 10 SMH10 0,03 0,124 0,205 0,303 0,667 0,583 0,501 0,381 11 SMH11 0,03 0,118 0,125 0,247 0,356 0,702 0,483 0,211 12 SMH12 0,03 0,202 0,229 0,335 0,478 0,776 0,347 0,186 13 SMH13 0,03 0,106 0,112 0,361 0,469 0,332 0,257 0,164 14 SMH14 0,03 0,158 0,223 0,307 0,409 0,557 0,651 0,320 15 SMH15 0,03 0,213 0,224 0,486 0,502 0,702 0,603 0,221 16 SMH16 0,03 0,262 0,314 0,429 0,484 0,550 0,405 0,331 17 SMH17 0,03 0,104 0,228 0,373 0,550 0,567 0,682 0,318 18 SMH18 0,03 0,289 0,430 0,447 0,580 0,707 0,754 0,521 19 SMH19 0,03 0,115 0,260 0,404 0,500 0,531 0,544 0,323 20 SMH20 0,03 0,208 0,317 0,400 0,455 0,477 0,389 0,157 21 SMH21 0,03 0,204 0,345 0,401 0,534 0,553 0,429 0,336 22 SMH22 0,03 0,177 0,241 0,369 0,559 0,600 0,619 0,243 23 SMH23 0,03 0,222 0,286 0,318 0,415 0,522 0,703 0,301 24 SMH24 0,03 0,110 0,123 0,380 0,449 0,589 0,389 0,215 25 SMH25 0,03 0,224 0,286 0,312 0,475 0,687 0,531 0,204 26 SMH26 0,03 0,105 0,217 0,235 0,458 0,691 0,273 0,219 27 SMH27 0,03 0,216 0,220 0,335 0,673 0,435 0,211 0,003 28 SMH28 0,03 0,238 0,243 0,362 0,699 0,712 0,308 0,115 29 SMH29 0,03 0,254 0,312 0,318 0,267 0,583 0,689 0,210 30 SMH30 0,03 0,210 0,225 0,468 0,504 0,531 0,372 0,206 31 SMH31 0,03 0,372 0,428 0,429 0,508 0,714 0,313 0,251 32 SMH32 0,03 0,122 0,256 0,337 0,577 0,423 0,308 0,207 33 SMH33 0,03 0,297 0,315 0,446 0,554 0,650 0,682 0,240 34 SMH34 0,03 0,104 0,343 0,412 0,524 0,564 0,326 0,105 35 SMH35 0,03 0,157 0,237 0,426 0,525 0,342 0,206 0,111
Chủng SMH1 và SMH2 do có khả năng sinh axit lactic cao nhất (số liệu ở
Bảng 3) nên được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính probiotic ở điều kiện
3.1.3. Kết quả định danh chủng vi khuẩn được tuyển chọn từ mẫu sữa mẹ
Dựa vào kết quả giải trình tự gen 16S rRNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu trên GenBank, chủng SMH1 có độ tương đồng về trình tự gen 16S rRNA 99,5% với loài Lactobacillus rhamnosus NCTC13764 nên được đặt tên là
Lactobacillus rhamnosus SMH1 với mã số đăng ký trên Genbank là MK791735;
chủng SMH2 có độ tương đồng về trình tự gen 16S rRNA 99,3 % với loài
Lactobacillus reuteri DSM 20016 nên được đặt tên là Lactobacillus reuteri SMH2
với mã số được đăng ký trên Genbank là MK791734. Trình tự gen 16S rRNA và các đặc điểm của 2 chủng vi khuẩn tuyển chọn (Bảng 4) được trình bày dưới đây.
+ Lactobacillus rhamnosus SMH1 CCGGCCCAAACTTCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGATTCTTCCACAATGGACGC AAGTTTGAAGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAAC TCTGTTGTTGGAGAAGAATGTTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTAT CCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG TGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTA AGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGTGCATCGGAAACTGGGA AACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGT AGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGAC GCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAT GCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAG CTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAA AGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGC AACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGG TTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGT CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCC AGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTAC ATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCC ATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTA GTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATAGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG CCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTA GGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGGGACAAATGATTAGGGTGAAGTCG + Lactobacillus reuteri SMH2 TAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGA ATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA CACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAA CCTTTATGGAGGGAGCCGCCTAAGGCGGGACAGATGACTGGGGGAAGT
Bảng 4. Đặc điểm của các chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn Chủng tuyển chọn – Mã số trên NCBI Chủng chuẩn tương đồng nhất trên ngân hàng Genbank NCBI – Mã số trên NCBI Điểm số tương đồng (%) Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch MRS Ảnh nhuộm Gram (độ phóng đại 100x) Ảnh SEM (độ phóng đại 104x) Lactobacillus rhamnosus SMH1 - MK791735 Lactobacillu s rhamnosus NCTC13764 - NZ_LR134331 99,5 Lactobacillus reuteri SMH2 - MK791734 Lactobacillu s reuteri DSM 20016 - NR_075036 99,3
3.2. Kết quả đánh giá một số tính chất, hoạt tính và điều kiện nhân giống của chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro
3.2.1. Kết quả đánh giá một số tính chất và hoạt tính probiotic của chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro
Hệ vi sinh vật âm đạo được chi phối bởi Lactobacilli ở phụ nữ khỏe mạnh [55]. Lactobacilli đóng một vai trị quan trọng trong việc duy trì cân bằng hệ sinh thái vi sinh vật âm đạo [93], [70]. Vai trò bảo vệ của Lactobacilli được dựa trên một số cơ chế: bám dính đặc hiệu vào biểu mơ âm đạo và và ức chế mầm bệnh bám vào bề mặt biểu mô âm đạo, cạnh tranh các chất dinh dưỡng với một số vi khuẩn niệu sinh dục, sản xuất các chất chuyển hóa hoạt động bao gồm axit hữu cơ - chủ yếu là axit lactic góp phần duy trì pH âm đạo thấp (pH 4-4,5), H2O2 thường sinh ra bởi Lactobacilli có trong âm đạo khỏe mạnh, sản xuất ra bacteriocin kháng lại các vi
sinh vật gây hại [107], [93], [70], [119]. Mặc dù vậy lại có sự khác biệt đáng kể giữa các chủng Lactobacillus spp. trong việc bảo vệ hệ vi sinh vật khỏe mạnh ở âm đạo [74]. Chính vì vậy, trong khn khổ của nghiên cứu này các đặc tính probiotic của chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 đã được chúng tơi nghiên cứu sâu hơn, đó là khả năng sinh axit lactic, khả năng sinh H2O2, khả năng tạo màng biofilm, khả năng kháng với các vi sinh vật và nấm có hại. Ngồi ra, với mục đích sản xuất chế phẩm probiotics cho phụ nữ chứa chủng tuyển chọn dạng viên nang đường uống, chúng tôi nghiên cứu thêm khả năng chịu muối mật, khả năng chịu axit và khả năng nhạy cảm với kháng sinh của các chủng tuyển chọn.
3.2.1.1. Khả năng sinh trưởng
Kết quả thử nghiệm khả năng sinh trưởng của chủng L. rhamnosus SMH1, L.
reuteri SMH2 và chủng đối chứng được thể hiện ở Hình 7.
Hình 7. Đường cong sinh trưởng và lượng axit lactic sinh ra theo thời gian của
chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng Kết quả cho thấy cả 3 chủng đều có pha sinh trưởng (pha log) từ khoảng 2 giờ đến 12 giờ. Giá trị OD620 trung bình của 2 chủng tuyển chọn luôn cao hơn so với chủng đối chứng và cao nhất đạt ~ 1,84 (SMH1) và ~ 1,87 (SMH2) sau 12 giờ. Pha suy vong của 2 chủng tuyển chọn bắt đầu sau 32 giờ ni cấy trong khi đó pha suy vong của chủng đối chứng bắt đầu sớm hơn sau 28 giờ nuôi cấy. Qua đây, khoảng thời gian chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 sinh trưởng tốt nhất đã được xác định với mục đích nhân giống chủng.
3.2.1.2. Khả năng sinh axit lactic
Kết quả kiểm tra lượng axit lactic sinh ra cũng được biểu diễn ở Hình 7. Kết
quả trên cho thấy lượng axit lactic sinh ra tại tất cả các mốc thời gian của 2 chủng tuyển chọn đều cao hơn so với chủng đối chứng. Trong vịng 12 giờ đầu lượng axit
Chú thích:
- Chủng đối chứng: Lactobacillus
reuteri VTCC 910087 (Viết tắt: ĐC);
- Chủng nghiên cứu:
Lactobacillus rhamnosus SMH1 (Viết
tắt: SMH1);
Lactobacillus reuteri SMH2 (Viết tắt:
sinh ra của 2 chủng này tăng chậm và khơng có sự chênh lệch nhiều nhưng từ sau 12 giờ, lượng axit lactic sinh ra của 2 chủng tuyển chọn tăng nhanh với lượng axit lactic cao nhất đạt xấp xỉ 14 g/L (L. reuteri SMH2) và 13 g/L (L. rhamnosus SMH1) tại 32 giờ. Sau 32 giờ nuôi cấy, mơi trường ni cấy chủng 2 chủng tuyển chọn có pH giảm xuống ở khoảng 3-4.
Chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 với khả năng sinh ra lượng axit lactic cao làm giảm pH môi trường (giảm xuống pH 3-4, đây là mức pH bình thường của mơi trường âm đạo) do đó có khả năng ức chế các vi khuẩn và nấm có hại trong âm đạo phụ nữ, pH cho sinh trưởng của vi khuẩn và nấm có hại là pH > 4,5 và cũng chính là nguyên nhân gây ra viêm nhiễm âm đạo [66]. Với định hướng sản xuất chế phẩm probiotics dạng viên nang đường uống, 2 chủng tuyển chọn thuộc 2 lồi lợi khuẩn cịn hỗ trợ sức khỏe đường ruột một cách hiệu quả. Axit lactic mà chúng sinh ra giúp ngăn chặn sự sống sót của vi khuẩn và nấm có hại trong đường tiêu hóa. Chẳng hạn, L. rhamnosus có thể ngăn chặn C. albicans có hại xâm chiếm thành ruột [104]. L. rhamnosus không chỉ ngăn chặn vi khuẩn xấu xâm nhập mà còn khuyến khích sự phát triển của các vi khuẩn có lợi, chẳng hạn như
Bacteroides, Clostridia và Bifidobacteria [37]. Hơn nữa, L. rhamnosus còn giúp
tăng cường sản xuất các axit béo chuỗi ngắn, chẳng hạn như acetate, propionate và butyrate [52]. Các axit béo chuỗi ngắn được tạo ra khi vi khuẩn đường ruột khỏe mạnh lên men chất xơ bên trong đường tiêu hóa. Chúng là nguồn ni dưỡng cho các tế bào lót đại tràng của bạn [63]. Điều này cũng tương tự như đặc tính của chủng L. reuteri RC-14® đã được thử nghiệm lâm sàng do có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn gây bệnh ở cả ruột và vùng sinh dục bằng cách sản xuất ra axit lactic [51], [21], [77].
3.2.1.3. Khả năng chịu muối mật
Kết quả thử nghiệm khả chịu muối mật của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng được thể hiện ở Hình 8.
Hình 8. Khả năng chịu muối mật của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2
và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087
Kết quả cho thấy cả chủng L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng đều phát triển kém trong mơi trường có chứa muối mật. Ở mơi trường muối mật 0,3% chủng
L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng đều phát triển và tăng sinh sinh khối sau 4 giờ
ni cấy trong khi đó điều này lại ngược lại đối với mơi trường muối mật 3%, 2 chủng đều phát triển yếu với số đo OD620 giảm sau 4 giờ nuôi cấy từ ~ 0,3 xuống ~ 0,26 đối với chủng L. reuteri SMH2 và từ ~ 0,3 xuống ~ 0,18 đối với chủng đối chứng. Tuy nhiên, điều này lại ngược lại với chủng L. rhamnosus SMH1, ở môi trường muối mật 0,3% chủng này phát triển mạnh nhất trong 3 chủng và phát triển mạnh hơn nữa khi tăng nồng độ muối mật trong môi trường lên 3% (số đo OD620 từ
~ 0,64 lên ~ 0,87). Điều này chứng tỏ chủng L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 đều có khả năng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt. Khả năng chịu muối mật có liên quan tới khả năng sống sót của vi khuẩn trong đường tiêu hóa của con người do muối mật là một thành phần có trong ruột, giúp tiêu hóa thức ăn. Vi khuẩn lactic sống trong ruột của con người có khả năng chịu được muối mật sẽ sống sót và tiếp tục sinh trưởng. Kết quả này cũng trùng với kết quả của Balasingham và đồng tác giả khi nghiên cứu trên L. acidophilus và L. plantarum [17].
3.2.1.4. Khả năng chịu axit
Kết quả kiểm tra khả năng chịu axit của chủng L. rhamnosus SMH1, L.
reuteri SMH2 và chủng đối chứng biểu diễn ở Hình 9. Cả 3 chủng đều phát triển
tương đối tốt trong môi trường MRS pH 5 và pH 6 nhưng phát triển tốt nhất ở môi trường pH 6. Ở môi trường pH 2 - 4, chủng L. reuteri SMH2 đều phát triển kém, số đo OD620 đều giảm sau 3 giờ, tuy nhiên điều này lại ngược lại với chủng L. rhamnosus SMH1, ở điều kiện pH rất thấp chủng này vẫn có khả năng sinh trưởng
Hình 9. Khả năng chịu axit của chủng chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2
và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087
Hai chủng tuyển chọn có khả năng chịu axit, sống sót được ở mơi trường pH từ 2 đến 4 nhất là chủng L. rhamnosus SMH1 cịn phát triển tốt trong mơi trường pH thấp, giúp chúng không bị tiêu diệt như các vi khuẩn và nấm có hại trong âm đạo. Nếu sản xuất thực phẩm chức năng probiotics cho phụ nữ dạng uống, 2 chủng này vẫn có khả năng tồn tại và sinh trưởng trong dạ dày người (có pH 2-3). Nói cách khác chúng có khả năng chống chịu với điều kiện axit của dạ dày để đi đến ruột non và sống sót đến khi xuống âm đạo. Kết quả này cũng trùng với kết quả của Đào Thị Lương và đồng tác giả khi nghiên cứu khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic [5].
Ngoài ra, ở một nghiên cứu khác, ba chủng L. rhamnosus phân lập từ phô mai Parmigiano Reggiano, L. rhamnosus ATCC 7469T và chủng thương mại L.
rhamnosus GG cũng đã được thử nghiệm để nghiên cứu khả năng chống chịu trước
các yếu tố khắc nghiệt khác nhau khi sinh trưởng in-vitro, đó là một số điều kiện của môi trường đường ruột như pH thấp và lượng muối mật và axit khác nhau. Kết quả thử nghiệm cho thấy các chủng L. rhamnosus phân lập từ phô mai Parmigiano Reggiano cho kết quả tương tự như L. rhamnosus GG [95]. Chủng L. rhamnosus GG và chủng L. rhamnosus ATCC 53103 đáp ứng các đặc điểm cần thiết sau đây cho một probiotic lý tưởng: chống chịu với axit dạ dày và muối mật để nó có thể sống sót qua đường tiêu hóa, khả năng nhân lên liên tục và bám vào các tế bào biểu mô ruột của con người và xâm chiếm ruột, sản xuất một chất chống khuẩn, tốc độ tăng trưởng nhanh và các ảnh hưởng tích cực cho sức khỏe. Đây là một trong những
chủng vi khuẩn có lợi được nghiên cứu rộng rãi nhất và ảnh hưởng của nó đến sức khỏe con người đã được kiểm tra trong nhiều thử nghiệm lâm sàng [42]. Chủng L.
reuteri Pg4 (T-Pg4) thể hiện tính chống chịu trong các điều kiện axit, khi tiếp xúc
với muối mật; bám dính hiệu quả vào các tế bào biểu mơ ruột của gà. Phát hiện này đã chứng minh rằng L. reuteri PG4 có thể sống sót khi vận chuyển qua dạ dày và ruột do đó, chủng này có khả năng đưa vào sản xuất chế phẩm probiotics cho gia cầm [116].
Hai chủng tuyển chọn vừa có khả năng sinh lượng axit lactic cao, vừa có khả năng sống sót dưới điều kiện pH thấp, vừa có khả năng chịu muối mật cũng như sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kị khí nên chúng rất có tiềm năng khi đưa vào sản xuất thực phẩm chức năng probiotics giành riêng cho phụ nữ ở Việt Nam. Việc nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức năng probiotics chứa L. rhamnosus SMH1 và L. reuteri SMH2 được phân lập từ sữa mẹ giúp duy trì khu hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh cho phụ nữ là việc làm thiết thực và có ý nghĩa cao cho cộng đồng.
3.2.1.5. Khả năng sinh H2O2
H2O2 là một chất oxy hóa mạnh và được coi là chất kháng khuẩn tốt do vi sinh vật có lợi tiết ra để chống lại các vi khuẩn có hại khi gặp điều kiện sống bất lợi.
Hình 10. Khả năng sinh H2O2 của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và