CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.4. Nghiên cứu các công thức phối trộn làm tăng mật độ sống sót sau quá
trình đơng khơ của các chủng được tuyển chọn
2.2.4.1. Thu sinh khối chủng vi khuẩn tuyển chọn
Từ kết quả thí nghiệm ở mục 2.2.3 và 2.2.4, các điều kiện nhân giống tối ưu của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng đã được chúng tôi đưa ra. Tiến hành nuôi chủng tuyển chọn và chủng đối chứng trong 5 lít mơi trường MRS lỏng với các điều kiện tối ưu kể trên, ly tâm thu sinh khối chủng vi khuẩn ở gần cuối pha log (10 – 12 giờ) để đảm bảo các chủng đó có tỉ lệ sống cao nhất trước khi phối trộn cùng các chất bảo vệ và đông khô.
2.2.4.2. Xác định mật độ sống CFU/g (mL) của chủng vi khuẩn được tuyển chọn trước khi phối trộn chất bảo vệ
Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn sau đó xác định mật độ sống trước khi đông khô của mỗi chủng vi khuẩn bằng phương pháp xác định số khuẩn lạc CFU/g (mL). Tiến hành pha loãng thập phân mỗi mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% và bằng dung dịch muối đệm phốt phát PBS [110]; cấy trải 100 µL trên đĩa thạch MRS (đường kính 10 cm) ở 3 nồng độ pha lỗng 10-6, 10-7 và 10-8; ni cấy kị kí trong 24 - 48 giờ và đếm số lượng khuẩn lạc sau đó tính ra CFU/g (mL) theo cơng thức sau:
CFU/g (mL) = a x 1/k x 1/V [23]
Trong đó:
+ a – số khuẩn lạc trên các đĩa có cùng nồng độ pha lỗng (lấy số khuẩn lạc trung bình); + k – độ pha lỗng của dịch lắc ni cấy;
+ V – thể tích dung dịch pha lỗng được cấy trên đĩa (đổi ra đơn vị mL).
Lưu ý chọn đĩa ni cấy có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25 đến 300. Nếu 2 đĩa có cùng nồng độ pha lỗng thì số khuẩn lạc đếm được chỉ được chênh nhau khoảng 10%. Khi pha lỗng xuống 10 lần thì số khuẩn lạc cũng giảm xuống 10 lần.
2.2.4.3. Nghiên cứu các công thức phối trộn làm tăng mật độ sống sót sau q trình đơng khơ của các chủng được tuyển chọn
Bảng 1. Thử nghiệm các công thức phối trộn sinh khối chủng probiotic
với các chất bảo vệ
Lô
TN Tỉ lệ phối trộn (không chất độn) TLTK
1 Sữa gầy 70% sinh khối và 30% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và sucrose) (1)
Thêm Glycerol [43]
3 70% sinh khối và 30% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và vitamin C) (2)
Thêm Glycerol
[117]
4 Không thêm Glycerol
5 92,8% sinh khối và 7,2% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và sucrose) (3)
Không thêm Glycerol [43], [117] 6 91,5% sinh khối và 7,2% chất bảo vệ
(gồm sữa gầy và vitamin C) (4) 7
Mannitol
70% sinh khối, 30% mannitol (5) Thêm Glycerol
[84], [43], [117]
8 Không thêm Glycerol
9 81,5% sinh khối và 18,5% chất bảo vệ (gồm mannitol và vitamin C) (6)
Thêm Glycerol
10 Không thêm Glycerol
11 84% sinh khối, 16% mannitol (7)
Không thêm Glycerol 12 82,8% sinh khối và 18,5% chất bảo
vệ (gồm mannitol và sucrose) (8)
13 80% sinh khối và 20% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và mannitol) (9) 14 80% sinh khối và 20% chất bảo vệ (maltodextrin
và microcrystalline cellulose) (10)
Chế phẩm Optibac probiotics for women - Anh
15 ĐC (-) Không phối trộn
2.2.4.4. Đông khô và xác định mật độ sống sót sau đơng khơ
10 gam hỗn hợp sau phối trộn được dàn lên đĩa petri nhựa (mỗi một công thức phối trộn làm 2 đĩa), các đĩa được để đơng lạnh sau đó đem đi đơng khơ. Cài đặt chương trình cho q trình đơng khơ: nhiệt độ -50oC trong 20 - 30 giờ.
Hình 6. Máy đơng khơ vi khuẩn
Các lơ thí nghiệm cùng đối chứng được xác định mật độ sống sót CFU/g ngay sau khi đơng khơ để tìm ra công thức hiệu quả nhất. Sau khi đông khô, hỗn hợp được trộn thêm cùng một số chất độn và tiếp tục được nghiên cứu.