Số liệu từ hình 19 cho thấy vị trí khối u tập trung chủ yếu ở trực tràng và đại tràng, một phần nhỏ ở vùng giữa đại và trực tràng (2/61 bệnh nhân). Alen G xuất hiện với tần suất cao nhất ở ung thƣ ở vùng giữa đại và trực tràng (100%), tiếp đó là ung thƣ trực tràng (62,1%), cuối cùng là ung thƣ đại tràng (43,33%). Alen A không xuất hiện ở vùng giữa đại và trực tràng. Có sự khác nhau giữa tần suất các alen với vị trí khối u, tuy vậy sự khác nhau này khơng mang ý nghĩa thống kê (χ2 = 3,838 < χ2
2(0,05) = 5,991, p>0,05).
- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo kích thƣớc u
Kích thƣớc khối u đƣợc biết đến nhƣ là một trong những yếu tố giúp tiên lƣợng bệnh ung thƣ đại trực tràng, đặc biệt có ý nghĩa chẩn đốn trong ung thƣ đại tràng. Nó có liên quan đến q trình tiến triển và khả năng sống sót trong ung thƣ đại tràng [39]. Do đó chúng tôi đã tiến hành phân tích mới liên quan giƣ̃a đa hình A10398G vớ i kích thƣ ớc khối u. Kết quả phân tích thớng kê đƣơ ̣c trình bày trong hình 20.
Hình 20. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo kích thƣớc u
Kết quả từ hình 20 cho thấy tần suất xuất hiện alen A trong nhóm có kích thƣớc u ≥ 5cm là 59%, alen G là 41%. Trong nhóm có kích thƣớc u < 5cm tần suất của alen G lại gần gấp đôi alen A (64,3% và 35,7%). Sự khác biệt giữa phân bố đa hình với kích thƣớc u khơng mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,71 < χ21(0,05) = 3,84, p>0,05.
- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo số hạch lympho
Số lƣợng hạch lympho là một trong những yếu tố quan trọng giúp phân loại giai đoạn bệnh và có ý nghĩa trong việc tiên lƣợng khả năng sống sót của bệnh nhân. Do đó chúng tơi đã tiến hành khảo sát đa hình A10398G theo số hạch lympho để tìm hiểu mối liên quan giữa chúng. Kết quả phân tích đƣợc biểu diễn trong hình 21.
Hình 21. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo số hạch.
Kết quả từ hình 21 cho thấy số hạch tăng lên thì tần suất xuất hiện alen G cũng tăng lên và đạt nhiều nhất ở nhóm có số hạch >3 (63%). Tần số alen A lớn nhất ở nhóm khơng xuất hiện hạch (66,67%). Nhƣ vậy ngƣời mang alen G có nguy cơ mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng với mức độ nguy hiểm cao hơn ngƣời mang alen A. Sự khác biệt giữa tần suất alen và số hạch không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,559 < χ22(0,05) = 5,991, p>0,05.
- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo giai đoạn phát triển khối u
Trong nghiên cứu này các giai đoạn phát triển khối u đƣợc phân loại theo hệ thống TNM, với 4 giai đoạn. Việc phân loại giai đoạn phát triển của bệnh có ý nghĩa rất lớn trong việc tiên lƣợng bệnh và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp. Chúng tơi đã tiến hành khảo sát, tìm hiểu mối liên quan giữa đa hình A10398G với các giai đoạn phát triển khối u. Kết quả phân tích đƣợc biểu diễn ở hình 22.
Hình 22. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giai đoạn TNM
Số liệu ở hình 22 cho thấy tần suất alen A cao nhất ở giai đoạn II, đạt tới 60%. Ở giai đoạn IV khơng có bệnh nhân nào mang alen A. Giai đoạn I là giai đoạn bệnh còn ở mức nhẹ, ung thƣ đã bắt đầu lây lan, nhƣng vẫn cịn trong lớp lót bên trong đại trực tràng, chƣa lan đến các cơ quan khác. Ở giai đoạn I này alen G có tần suất đạt 62,5%. Tiếp đó tần suất alen G có sự giảm ở giai đoạn II (40%) và tăng trở lại ở giai đoạn III (57,14%). Alen G có tần suất xuất hiện lớn nhất ở giai đoạn IV (100%). Đây là giai đoạn nặng nhất của bệnh với sự di căn của khối u tới các cơ quan xa (phổi, gan) thơng qua hệ bạch huyết. Khả năng sống sót của bệnh nhân sau 5 năm ở giai đoạn này chỉ đạt từ 0-7%. Điều này lại một lần nữa khẳng định cho giả thuyết alen G làm tăng nguy cơ đối với bệnh ung thƣ đại trực tràng. Sự khác biệt giữa phân bố đa hình A10398G với các giai đoạn phát triển ung thƣ TNM không mang ý nghĩa thống kê với χ2
= 4,675 < χ23(0,05) = 7,814, p>0,05.
- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thƣ đại
trực tràng theo mức độ biệt hóa
Mức độ biệt hóa là một khái niệm dùng để chỉ mức độ giống các tế bào bình thƣờng cùng một loại mô của các tế bào u. Mức độ ác tính của ung thƣ có liên quan trực tiếp đến nguồn gốc của tế bào biệt hóa. Thơng thƣờng, những khối u có tính
chậm. Mặt khác những khối u có tính biệt hóa thấp thì độ ác tính lại cao, di căn nhanh. Kết quả của việc khảo sát đa hình A10398G ADN ty thể theo mức độ biệt hóa đƣợc biểu diễn trong hình 23.
Hình 23. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo mức độ biệt hóa
Kết quả từ hình 23 cho thấy tần suất alen G tăng dần với sự giảm của mức độ biệt hóa, đồng nghĩa với việc tăng dần của độ ác tính và tốc độ di căn của khối u. Đối với alen A thì ngƣợc lại, đạt cao nhất ở mức đơ độ biệt hóa cao (60%), thấp nhất ở mức biệt hóa kém (0%). Kết quả này cũng phù hợp với giả thuyết alen G làm tăng mức độ nguy hiểm với bệnh ung thƣ đại trực tràng. Sự khác biệt giữa tần suất alen và mức độ biệt hóa khơng mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,366 < χ22(0,05) =
5,991, p>0,05.
Nhƣ vậy qua việc khảo sát sự phân bố đa hình A10398G theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng, chúng ta thấy đƣợc một số đặc điểm sau:
- Tần suất xuất hiện của alen A ở mô u và mô lân cận u là 46%, của alen G là 54%. Khơng có sự khác biệt về tần suất alen giữa mô u và mô lân cận u. Sự phân bố đa hình này phù hợp với các nghiên cứu về đa hình A10398G trên đối tƣợng ngƣời châu Á (khu vực miền Bắc Ấn Độ: 57,3%, Trung Quốc 57,1%).
- Alen A và G phân bố trên cả nam và nữ. Tần suất alen G ở nam là 50%, ở nữ là 58,1%. Ở nhóm có độ tuổi ≥ 50, tần suất alen G là 52,2%, ở nhóm <50 tuổi, tần suất alen G là 60%. Alen G xuất hiện nhiều ở ung thƣ trực tràng và ung thƣ giữa đại và trực tràng. Với nhóm có khối u kích thƣớc nhỏ hơn 5cm, alen G chiếm 64,3%. - Khảo sát mối liên quan giữa đa hình A10398G với các đặc điểm nhƣ số hạch lympho, giai đoạn phát triển khối u, mức độ biệt hóa cho thấy tần suất alen G tăng dần với sự tăng của số hạch, sự tăng của giai đoạn phát triển bệnh và sự giảm của mức độ biệt hóa. Điều này cho thấy alen G có mối liên quan với nguy cơ mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng.
Mối liên quan giữa đa hình A10398G với sự phát triển của khối u đã thu đƣợc nhiều mối quan tâm của các nhà nghiên cứu trong những năm gần đây. Canter và cs (2005) lần đầu tiên phát hiện mối liên quan giữa đa hình A10398G với bệnh ung thƣ vú trên những ngƣời phụ nữ Mỹ gốc Phi, trong đó alen A là yếu tố gây nguy cơ mắc bệnh, có khả năng tham gia vào q trình tạo gốc tự do. Tuy vậy, các tác giả khơng tìm thấy mối liên hệ nào ở ngƣời Mỹ da trắng. Các tác giả cho rằng sự tƣơng tác giữa các yếu tố gen và mơi trƣờng có thể gây ra sự khác nhau giữa các tộc ngƣời [18]. Tuy vậy, trong một số nghiên cứu khác trên đối tƣợng là phụ nữ Mỹ gốc Phi không thấy vai trị của đa hình 10398A đối với sự phát triển của ung thƣ vú [55]. Các tác giả đã giải thích sự khác nhau về kết quả của các nghiên cứu này là do sự khác nhau của các điều kiện trong các khu vực địa lý khác nhau. Trong một số nghiên cứu khác, alen G lại có liên quan với sự phát triển khối u. Bai và cs (2007) khi nghiên cứu trên 156 ngƣời phụ nữ Mỹ gốc Âu mắc bệnh ung thƣ vú và 260 mẫu đối chứng thấy rằng 10398G có liên quan với làm tăng nguy cơ ung thƣ vú [12]. Một nghiên cứu độc lập khác cũng phát hiện 10398G có liên quan với sự phát triển ung thƣ vú trên đối tƣợng là ngƣời Ba Lan [25]. Khi nghiên cứu trên đối tƣợng là ngƣời Mỹ gốc Phi mắc ung thƣ tiền liệt tuyến, ngƣời ta thấy rằng 10398G làm tăng tỷ lệ và mức độ ác tính của bệnh.
Nhƣ vậy vẫn tồn tại những kết quả dƣờng nhƣ trái ngƣợc về việc xác định alen nào nào thƣc sự có vai trị với sự phát triển của khối u. Chúng ta biết rằng các
đột biến soma có thể bị gây ra bởi tác động của yếu tố ngoại cảnh, nhƣ tia cực tím, hay một số thói quen nhƣ hút thuốc, sử dụng bia rƣợu. Các yếu tố này đều góp phần làm tăng lƣợng gốc tự do trong cơ thể. Theo một số nghiên cứu, cùng với sự tăng của các gốc tự do, mtSNP sẽ có vai trị trong việc phát triển ung thƣ, có thể hoạt hóa con đƣờng gây ung thƣ, hoặc có thể hoạt hóa phản ứng apoptosis, vốn đóng vai trị là yếu tố bảo vệ trong giai đoạn cuối của ung thƣ. Nhƣ vậy phải chăng các alen A hoặc G trong đa hình A10398G có thể cần kết hợp với một vài yếu tố nào đó để từ đó hình thành nên mối liên hệ với sự hình thành khối u. Chúng ta có thể thấy rõ hơn khả năng này nhờ nghiên cứu của Pezzotti và cs (2009). Khi phân tích mối liên quan giữa việc sử dụng chất có cồn với đa hình A10398G ở bệnh nhân mắc bệnh ung thƣ vú, Pezzotti và cs (2009) đã phát hiện ra rằng ở những ngƣời phụ nữ không sử dụng rƣợu và mang alen G, nguy cơ mắc ung thƣ vú thấp hơn 21% so với những ngƣời không uống rƣợu và không mang alen này [52]. Nhƣ vậy việc sử dụng cồn là một yếu tố kết hợp với alen G trong đa hình A10398G để hình thành mối liên hệ giữa đa hình với bệnh ung thƣ vú.
Tóm lại, trong nghiên cƣ́ u này, chúng tơi đã tiến hành phân tích đ ột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Kết quả phân tích bằng kỹ thuật RFLP 61 cặp mẫu mô u và mẫu mô lân cận u c ủa 61 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng cho thấy khơng xuất hiện đột biến A3243G mã hóa cho gen tARNLeu. Khi tiến hành phân tích đa hình A10398G của gen ND3 của ADN ty thể, chúng tôi đã xác định đƣợc tần xuất của alen A và G trên 61 cặp mẫu mô u và mẫu mô lân câ ̣n u của 61 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Kết quả phân tích cho thấy tỷ lê ̣ alen G trong nh óm bệnh nhân đƣợc nghiên cứu tƣơng ứng với tỷ lệ alen G đã đƣơ ̣c công bố bởi các tác giả khác khi nghiên cƣ́u trên các nhóm ngƣời ở các nƣớc Châu Á. Ngoài ra, sự khác biệt giữa phân bố đa hình A10398G theo các đă ̣c điểm bê ̣nh ho ̣c l âm sàng của bê ̣nh ung thƣ đ ại trực tràng nhƣ vi ̣ trí mô , tuổi, giới tính, kích thƣớc u, số hạch lympho, giai đoạn tiến triển bệnh, mức độ biệt hóa khơng mang ý nghĩa thống kê (p>0,05). Tuy nhiên, do số lƣơ ̣ng bê ̣nh nhân đƣơ ̣c nghiên
cƣ́u còn chƣa n hiều nên viê ̣c nghiên cƣ́u với số lƣợng bê ̣nh nhân cao hơn là cần thiết để khẳng đi ̣nh kết quả thu đƣợc.
KẾT LUẬN
Tƣ̀ nhƣ̃ng kết quả thu đƣợc chúng tôi rút ra mô ̣t số kết luâ ̣n sau:
1. Đã tách đƣợc ADN tổng số từ 61 cặp mẫu mô của bệnh nhân ung thƣ đại trƣ̣c tràng (bao gồm mô u và mô lân cận ở mỗi bệnh nhân). ADN thu đƣợc đạt độ sạch cần thiết, đáp ứng đƣợc các yêu cầu thí nghiệm.
2. Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã khuếch đại thành công các đoa ̣n gen ch ứa vị trí đột biến 3243 (kích thƣớc 218 bp) và 10398 (kích thƣớc 246 bp) của ADN ty thể từ mẫu mô của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng.
3. Phân tích RFLP đã xác đi ̣nh đƣơ ̣c tần xuất alen 10398G là 54 % mô u, 54 % mô lân câ ̣n u. Tính chung là 54%.
4. Phân bớ đa hình A10398G không phu ̣ thuô ̣c vào các đặc điểm bệnh học lâm sàng nhƣ vi ̣ trí mô , t̉i, giới tính, kích thƣớc u, số hạch lympho, giai đoạn tiến triển bệnh, mức độ biệt hóa (p>0,05).
5. Không tìm thấy đô ̣t biến A 3243G của ADN ty thể ở các bê ̣nh nhân un g thƣ đại trực tràng đƣợc nghiên cƣ́u.
KIẾN NGHỊ
Tƣ̀ quá trình nghiên cƣ́u thƣ̣c tế chúng tôi đƣa ra mô ̣t số kiến nghi ̣ sau:
1. Tiếp tục phân tích đ ột biến gen tARN và ND 3 của ADN ty thể trên đối tƣợng bê ̣nh nhân ung thƣ đ ại trực tràng với số lƣợng mẫu lớn hơn để có kết quả đánh giá chính xác tần xuất cũng nhƣ mối liên hệ giữa đ ột biến gen tARN và ND3 với bê ̣nh ung thƣ đại trực tràng ở ngƣời Viê ̣t Nam.
2. Tiến hành phân tích đ ột biến gen tARN và ND 3 của ADN ty thể bằ ng các kỹ thuâ ̣t PCR đi ̣nh lƣơ ̣ng , dHPLC để xác đi ̣nh mƣ́c đô ̣ không đồng nhất của ADN ty thể ở các bê ̣nh nhân đƣợc nghiên cƣ́u.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đái Duy Ban (2003), "Bƣớc đầu nghiên cứu ung thƣ vú bệnh nhân Việt Nam bằng phƣơng pháp sinh học phân tử sử dụng chỉ thị di truyền hệ gen ty thể vùng D- Loop", Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, nghiên
cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học, pp. 825-830.
2. Phan Văn Chi (2006), "Nghiên cứu giải mã genome ty thể các tộc ngƣời Việt Nam và định hƣớng ứng dụng". Báo cáo đề tài cấp nhà nƣớc (mã số: KC-04- 25).
3. Nguyễn Nhƣ Hiền (2010), Giáo trình sinh học tế bào, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
4. Chu Văn Mẫn (2009), "Tìm hiểu bệnh ty thể ở ngƣời bằng phƣơng pháp sinh học phân tử". Báo cáo đề tài ĐHQGHN (mã số: QT-08-31).
5. Nguyễn Hữu Nghĩa, Đặng Trần Trung và Tống Quang Vinh (2008), "Đột biến hệ gen ty thể vùng D-Loop ở ngƣời lao động thƣờng xuyên tiếp xúc với bức xạ ion hóa", Tạp chí Y học Việt Nam, 351, pp. 29-34.
6. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
7. Lê Đình Roanh và Nguyễn Văn Chủ (2008), Bệnh học các khối u, Nhà xuất bản y học Hà Nội.
8. Phạm Hùng Vân, Hoàng Hiếu Ngọc và Võ Quang Hồng Điểm (2010), "Các trƣờng hợp đầu tiên về bệnh lý thần kinh nhãn cầu LEBER xác định bằng kỹ thuật giải trình tự DNA ty thể tách chiết từ bạch cầu của bệnh nhân để phát hiện các đột biến gây bệnh", Kỷ yếu hội nghị Sinh học phân tử và hóa sinh y
học, pp. 285-289.
Tài liệu tiếng Anh
9. Alonso A., Martin P., and Albarran C. et al (1997), "Detection of somatic mutations in the mitochondrial DNA control region of colorectal and gastric
tumors by heteroduplex and single-strand conformation analysis",
Electrophoresis, 18, pp. 682-685.
10. Anderson S., Bankier A. T., and Barrell B. G. (1981), "Sequence and organization of the human mitochondrial genome", Nature, 290(1), pp. 457-
465.
11. Andrew R. M., Kubacka I., and Chinnery P. F. (1999), "Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA", Nature Genetics, 23(147).
12. Bai R. K., Leal S. M., and Covarrubias D. (2007), "Mitochondrial genetic background modifies breast cancer risk", Cancer Research, 67, pp. 4687-
4694.
13. Bassam B. J., Caetano-Anollés G., and Gresshoff P. M. (1991), "Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels", Analytical