100 bp; 1 - Sản phẩm Real-time PCR của gene chuẩn IPP1 100 bp
200 bp
M 1
3.3.2. Tối ƣu phản ứng Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1
Phản ứng Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1 đƣợc thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho gene MF(ALPHA)1. Chúng tôi khảo sát một mồi xuôi và 2 mồi ngƣợc.
Chƣơng trình chạy giống với gene IPP1, tuy nhiên đƣợc tiến hành ở nhiệt độ
gắn mồi là 58°C và 59°C.
Quan sát băng điện di cho thấy, ở nhiệt đợ gắn mồi là 58°C thì với cả 2 loại mồi ngƣợc đều cho sản phẩm Real-time PCR là vệt băng rõ nét đúng kích thƣớc. Tuy nhiên, quan sát thấy với mồi ngƣợc thứ nhất cho băng đậm hơn, kích thƣớc geneđúng với kích thƣớc của geneMF(ALPHA)1, chứng tỏ mồi ngƣợc này có đợ đặc hiệu cao hơn và chính xác hơn. Do vậy, với phản ứng Real-time PCR tiến hành trên gene đích MF(ALPHA)1 sẽ sử dụng mồi ngƣợc thứ nhất và chƣơng trình chạy sử dụng nhiệt đợ gắn mồi là 59°C.
Hình 3.8. Kết quả sản phẩm Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1 sử dụng 2 loại mồi ngƣợc và ở 2 nhiệt độ gắn mồi 58°C và 59°C;M - Thang chuẩn
DNA 100 bp; 1 - Phản ứng với mồi ngƣợc thứ nhất ở 59°C; 2 - Phản ứng với mồi ngƣợc thứ nhất ở 58°C; 3 - Phản ứng với mồi ngƣợc thứ hai ở nhiệt độ 59°C; 4 - Phản ứng với mồi ngƣợc thứ hai ở nhiệt độ 58°C.
202
bp 200
bp
100
3.4. Kết quả Real-time PCR với gene nội chuẩn IPP1
Để so sánh tƣơng đối hàm lƣợng RNA của đoạn gene MF(ALPHA)1 của các
chủng nấm men P. pastoris tại các thời điểm khác nhau, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp Real-time PCR định lƣợng tƣơng đối. Trong thí nghiệm real time PCR định lƣợng tƣơng đối, các gene nội chuẩn thƣờng đƣợc sử dụng. Các gene nội chuẩn (reference gene hay internal standard) là các gene mà sự biểu hiện phiên mã của chúng là không đổi ở các trạng thái tế bào khác nhau. Trong Real-time PCR, biểu hiện của gene đích thƣờng đƣợc so sánh với sự biểu hiện của một gene nội chuẩn nào đó để loại bỏ sai số trong q trình làm thí nghiệm.
Thực chất, việc tìm đƣợc mợt gene nợi chuẩn tốt là rất khó. Mợt số nghiên cứu sâu về một số gene nội chuẩn truyền thống nhƣ GAPDH, GPD, PBGD, ACT1, cho thấy rằng thực tế các sự biểu hiện của các gene này không phải là không đổi ở các điều kiện khác nhau [32]. Bên cạnh đó, do geneome của P. pastoris mới đƣợc công bố cách đây không lâu, các nghiên cứu chuyên sâu về sự biểu hiện phiên mã cịn hạn chế, việc tìm đƣợc mợt gene nợi chuẩn tốt càng khó khăn.
Nhiều nghiên cứu về gene nội chuẩn ở P. pastoris và S. cerevisiae đã đƣợc sử dụng trƣớc đó nhƣ HPRT, PBGD, GAPDH, G6PDH, RPL10, ALG9, ARG4, UBC6, TAF10, IPP1, chúng tơi chỉ tìm thấy mợt gene duy nhất dƣờng nhƣ là phù hợp với yêu cầu là gene IPP1 mã hóa cytoplasmic inorganic pyrophosphatase. Trình tự của gene IPP1 ở P. pastoris và S. cerevisiae giống nhau khoảng 70%. Tuy nhiên, các bợ mẫu dị đặc hiệu cho gene IPP1 ở S. cerevisiae khá tƣơng thích với IPP1 ở P. pastoris.
Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm với gene đích cần nghiên cứu là MF(ALPHA)1, chúng tôi đã thực hiện Real-time PCR nhằm nghiên cứu sự biểu hiện của gene nội chuẩn IPP1 trong các chủng control, Amy và IL-2 tại các thời điểm nghiên cứu 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ (Hình 3.9, Hình 3.10, Bảng 3.3).
1 - Đối chứng âm (nƣớc); 2, 5, 6 - Mẫu phản ứng của chủng Amylase tại 0, 24 và 48h; 7, 10, 11 - Mẫu phản ứng của chủng Control tại 0, 24 và 48h.