Cơ sở lý thuyết của PCR:
PCR (Polymerase chain reaction) là phƣơng pháp tổng hợp lƣợng lớn DNA in vitro trên cơ sở mẫu khn. Q trình tổng hợp DNA kéo dài mồi dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và khả năng kéo dài chuỗi của enzyme polymerase bền nhiệt (phổ biến là Taq polymerase – phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus). PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có ba bƣớc: biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Kết quả sau đến 2-3 giờ lƣợng DNA sẽ đƣợc khuếch đại lên khoảng 225-30 lần.
Thành phần phản ứng: TT Thành phần phản ứng Thể tích (µL) 1 Nƣớc 15,5 2 DNA khuôn 1 3 DreamTaq Buffer 10x 2,5 4 Mồi xuôi 1,5 5 Mồi ngƣợc 1,5 6 dNTP 2,5 mM 2,5
7 Dream Taq polymerase 0,5
Tổng thể tích phản ứng 25
Chƣơng trình chạy:
Bƣớc 1: Biến tính sợi DNA ở 94°C trong 2 phút. Bƣớc 2: Biến tính ở 94°C trong 10 giây.
Bƣớc 3: Gắn mồi trên sợi khn ở nhiệt đợ thích hợp trong 30 giây. Bƣớc 4: Tổng hợp, kéo dài chuỗi ở 72°C trong 30 giây.
Lặp lại 30 chu kỳ từ bƣớc 2 đến bƣớc 4.
2.2.4. Kỹ thuật Real-time PCR
Nguyên lý
Phản ứng Real-time PCR trên máy LightCycler của Roche sử dụng chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green I. Chất này có đặc điểm là khi trong dung dịch có DNA mạch kép thì nó sẽ gắn vào các sợi kép này và phát quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích. Ƣu điểm của SYBR Green I là có nhiễu nền thấp và khơng gắn quá chặt vào sợi kép nên không làm ảnh hƣởng nhiều đến hiệu suất của PCR. Máy LightCycler đƣợc lập trình để thu nhận các tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mẫu trong thời gian phản ứng. Lƣợng sản phẩm PCR càng lớn, tín hiệu thu đƣợc sẽ càng mạnh. Từ những tín hiệu này, máy sẽ số hóa và lƣu lại dƣới dạng dữ liệu thơ.
Tiến hành:
Phản ứng Real-time PCR tiến hành sử dụng bộ kit LightCycler RNA Master SYBR Green I của Roche với các cặp mồi đặc hiệu cho các geneMF(ALPHA)1.
Thành phần phản ứng: TT Thành phần Nồng độ gốc Thể tích hút (µL) 1 H2O 4.2 2 Mn(OAc)2 25 µM 1.3 3 Mồi xi 10 µM 1.0 4 Mồi ngƣợc 10 µM 1.0
5 RNA khuôn 20 ng/ul 5.0
6 RNA master mix 7.5
Tổng thể tích phản ứng 20
Chƣơng trình chạy:
Bƣớc 1: Phiên mã ngƣợc ở 61°C trong 30 phút Bƣớc 2: Biến tính ở 95°C trong 2 phút
Bƣớc 3: Khuếch đại: 40 chu kỳ, chế đợ Quantification Biến tính ở 95°C trong 10 giây
Gắn mồi ở 58°C cho gene IPP1 và 59°C cho gene MF(ALPHA)1 trong 30 giây Kéo dài ở 72°C trong 30 giây (chế độ single)
Bƣớc 4: Xây dựng đƣờng cong nóng chảy:
95°C trong 0 giây, 65°C trong 30 giây, 95°C trong 0 giây (Slope 0.1oC/s, continuous)
Bƣớc 5: Làm mát ở 40°C trong 30 giây
2.2.5. Xử lý số liệu sử dụng phần mềm LightCycler 4.0
Nguyên lý
Phần mềm LightCycler 4.0 đƣợc thiết kế bởi Roche, cho phép xử lý trực tiếp số liệu thô thu đƣợc từ máy LightCycler Version 2.0. Các bộ số liệu thô đƣợc lƣu trong phần mềm dƣới dạng các “thí nghiệm” và có thể đƣợc trích xuất dƣới định dạng file chuyên dụng là .ixo. Chức năng “Analysis” của phần mềm đƣợc dùng để xử lý số liệu theo nhiều cách khác nhau và đƣa ra kết quả cuối cùng.
Tiến hành: Chúng tôi sử dụng các phƣơng pháp xử lý số liệu sau:
Xác định chỉ số Ct (Crossing Point) của mẫu. Trong một phản ứng Real-time PCR, chu trình mà ở đó tín hiệu huỳnh quang của mẫu vƣợt lên trên mức huỳnh quang nền đƣợc gọi là Ct (Crossing Point) của mẫu đó. Trong đồ thị, Ct đƣợc thể hiệu khi đƣờng cong đi lên đột ngột, là điểm mà sản phẩm PCR bắt đầu hiện diện trong số liệu. Ct của một mẫu phụ thuộc vào nồng độ DNA ban đầu của mẫu đó. Mợt mẫu có nồng đợ DNA ban đầu thấp sẽ cần nhiều chu trình hơn và có chỉ số Ct cao, trong khi mẫu có nồng đợ cao hơn sẽ cần ít chu trình hơn và có Ct thấp.
Định lƣợng tƣơng đối đơn sắc/đơn kênh (Relative Quantification-Mono Color): Phân tích định lƣợng tƣơng đối dựa trên cơ sở là nồng độ DNA tại Crossing Point là nhƣ nhau với tất cả các mẫu chứa cùng mợt loại DNA đích. Mỗi mẫu địi hỏi mợt số chu trình khác nhau để đạt tới Crossing Point, tùy thuộc vào nồng độ DNA ban đầu trong mẫu. Đến cuối thí nghiệm, nồng đợ DNA của các mẫu cũng khác nhau, phụ thuộc vào số chu trình đã đƣợc hoàn thành sau khi mẫu đó đạt tới Crossing Point. Phƣơng pháp định lƣợng tƣơng đối sử dụng Ct, mức độ hiệu quả của phản ứng, số chu trình, và mợt số giá trị khác để xác định nồng độ DNA của các
mẫu đã tăng nhƣ thế nào khi kết thúc PCR. Các tính tốn sau đó sẽ đƣợc sử dụng để so sánh giữa các mẫu và tính ra tỉ lệ cuối cùng giữa gene đích và gene tham chiếu.
Đƣờng cong nóng chảy (Melting Curves) và đỉnh nóng chảy (Melting Peak): Nhiệt đợ nóng chảy của DNA có thể thay đổi trong mợt khoảng rợng, phụ tḥc vào trình tự, đợ dài, và thành phần GC của chuỗi. Chỉ cần sai khác một base giữa hai DNA đã có thể dẫn tới sự thay đổi nhiệt đợ nóng chảy. Chính bởi vậy, các chỉ số về nhiện đợ nóng chảy có thể đƣợc sử dụng để nhận diện sản phẩm DNA. Để phân tích nhiệt đợ nóng chảy, sự phát huỳnh quang của các mẫu cần đƣợc theo dõi trong khi nhiệt độ của máy LightCycler tăng lên chậm và đều. Khi nhiệt độ tăng, mức độ phát huỳnh quang sẽ giảm. Trong trƣờng hợp của chất nhuộm SYBR Green I, sự giảm này xảy ra do sự tách nhau của các mạch đơn trong DNA mạch kép, dẫn tới sự giải phóng các phân tử SYBR Green I.