CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. Kỹ thuật Real-time PCR
1.4.1. Tổng quan về Real-time PCR
Trong kỹ thuật PCR truyền thống kết quả của thí nghiệm chỉ đƣợc xác định khi đã hoàn tất các cơng đoạn của thí nghiệm, do đó cơng đoạn PCR thƣờng mất rất nhiều thời gian. Sự ra đời của kỹ thuật Real-time PCR là một bƣớc đột phá trong
công nghệ sinh học. Kỹ thuật này cho phép xác định kết quả của thí nghiệm sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR, chính vì vậy đƣợc gọi là “Real-time”. Kỹ thuật Real-time PCR đƣợc đặc trƣng bởi giới hạn định lƣợng rất rộng, độ nhạy cảm cao đủ để phát hiện một phân tử duy nhất và khả năng lặp lại cao (độ lệch chuẩn nhỏ hơn 0,2 chu kỳ) [6, 7, 18, 35] và phạm vi ứng dụng lớn. Sự ra đời của kỹ thuật Real- time PCR đã cải thiện đáng kể và đơn giản hóa định lƣợng DNA và RNA, kỹ thuật này đã trở thành mợt cơng cụ có giá trị lớn cho ngƣời nghiên cứu, đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử [17, 21, 34]. Các biểu hiện của tất cả các gene trong mợt mẫu có thể đƣợc tạm đánh giá bằng các kỹ thuật microarray. Nhƣng sự biểu hiện của gene đƣợc lựa chọn có thể đƣợc đo với đợ chính xác rất cao bởi Real- time PCR [6, 7]. Đây là phƣơng pháp tốt nhất để xác định số lƣợng của một DNA cụ thể trong một mẫu sinh học phức tạp, hay định lƣợng biểu hiện gen [21, 25]. Phƣơng pháp này đã khắc phục đƣợc hầu hết những thiếu sót và hạn chế lớn của những phƣơng pháp trƣớc đó. Việc sử dụng tính đặc hiệu và đợ nhạy của PCR kết hợp với sử dụng mồi huỳnh quang để phát hiện trực tiếp gene đích, qua đó loại bỏ đƣợc các vấn đề nhƣ: thuốc nḥm, chuyển màng, lai phóng xạ và thời gian làm thí nghiệm…[3].
Trong kỹ thuật Real-time PCR cả DNA và mRNA đều có thể đƣợc sử dụng làm mẫu thí nghiệm cho Real-time PCR. Nếu sử dụng mRNA làm mẫu phải đƣợc sao chép ngƣợc thành cDNA bằng RT-PCR. Bƣớc phiên mã ngƣợc (reverse transcript) là rất quan trọng quyết định đợ nhạy và tính chính xác khi định lƣợng, vì số lƣợng cDNA đƣợc tạo ra, phải phản ánh mợt cách chính xác số lƣợng đầu vào của mRNA. Kết quả RT có thể khác nhau hơn 100 lần trong các gene đích, sự khác nhau này do cấu trúc mRNA khác nhau, cách dùng mồi (hexamers, oligo (dT) hoặc mồi đặc hiệu của gene), và các đặc tính của enzyme sao mã ngƣợc (dải động, độ hoạt động của RNase và ổn định nhiệt) [6, 21, 31].
Phản ứng phiên mã ngƣợc và realtime có thể thực hiện trong mợt phản ứng RT-PCR, cách này đặc biệt là phù hợp khi phân tích mợt hoặc mợt vài gene và nó cũng giảm nguy cơ đồng nhiễm. Tuy nhiên, tối ƣu điều kiện phản ứng cho phản ứng
sao mã ngƣợc và Real-time PCR thƣờng khác nhau, và khi kết hợp một bƣớc cho phản ứng thƣờng giảm độ nhạy hơn so với phƣơng pháp cách làm hai bƣớc [6, 7]. Khi làm RT-PCR, có thể phát sinh tín hiệu dƣơng tính giả từ DNA trong mẫu. Để tránh vấn đề này mồi PCR để định lƣợng mRNA thƣờng đƣợc thiết kế với chiều dài trên một intron hoặc qua các biên exon [35]. Nếu nhƣ thiết kế thí nghiệm khơng phải xử lý mẫu thì phải đƣợc kiểm tra sự nhiễm mẫu, bằng cách chạy thử một vài mẫu nhƣng khơng phiên mã ngƣợc, nếu thấy phát tín hiệu là mẫu có thể bị nhiễm và phải xử lý bằng DNase trƣớc khi phiên mã ngƣợc [30]. Thơng thƣờng quy trình thực hiện một phản ứng Real-time PCR gồm các bƣớc: chuẩn bị mẫu, tách DNA hoặc RNA, tổng hợp cDNA, thiết kế mồi, cài đặt chƣơng trình cho phản ứng và phân tích kết quả[6, 30].
Chìa khóa làm nên tính ƣu việt của kỹ thuật Real-time PCR là việt sử dụng chất phát huỳnh quang có khả năng bắt vào sản phẩm PCR. Ngày nay, chất phát huỳnh quang đƣợc sử dụng nhƣ là phƣơng pháp phát hiện đặc hiệu trong Real-time PCR. Các huỳnh quang có thể đƣợc chia thành hai loại: loại đặc hiệu và loại không đặc hiệu [36]. Các chất không đặc hiệu nhƣ SYBR Green I và BeBo [5, 38], đây là các chất bắt cặp với đơi sợi DNA, do có ái lực cao với sợi đơi. Đợng học của phản ứng PCR thƣờng đƣợc xác định thông qua sự phát quang của các thuốc nhuộm
DNA. Cơ sở của Realtime-PCR là mối liên hệ thuận giữa tín hiệu thu đƣợc từ thuốc nhuộm với số bản sao của DNA [33].