Cấu trúc khơng gian của IL-2

Hình 1 .5 Cơ chế trao đổi chéo tại vị trí his4

Hình 1. 7 Cấu trúc khơng gian của IL-2

acid amin đầu tiên. IL-2 trong tự nhiên tồn tại dạng glycosyl hóa có tính thấm cao với màng tế bào do vậy liều lƣợng lớn IL-2 sẽ gây nên đợc tính của protein này trong cơ thể. Vì vậy, IL-2 dạng thƣơng phẩm dùng làm thuốc tiêm sẽ bị loại bỏ các gốc đƣờng ở đầu N [14].

1.3.2. Tổng quan về α-amylase:

Amylase là nhóm enzyme phổ biến có cả trong thực vật, động vật, và các vi sinh vật. Anselme Payen và Jean Peroz lần đầu tiên tinh sạch đƣợc amylase từ mạch nha và năm 1835 [20]. Cho đến ngày nay amylase vẫn là enzyme đƣợc sử dụng nhiều trong trong các lĩnh vực nhƣ: công nghiệp thực phẩm, sản xuất bia rƣợu, nƣớc uống, thuốc trong y học…

Amylase xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết glycoside của tinh bột, glycogen và các polysaccaride tƣơng tự. Sự tác đợng của nhóm enzyme này lên cơ chất theo hai hƣớng: các amylase nội phân cắt cơ chất một cách ngẫu nhiên tại các liên kết nằm bên trong phân tử và các amylase hƣớng ngoại thủy phân cơ chất từ đầu không khử. Cơ chất chủ yếu của amylase là tinh bột một loại polysaccaride dự trữ phổ biến ở thực vật. Đây là nguồn cung cấp cacbon, năng lƣợng chủ yếu cho đợng vật. Tinh bợt đƣợc hình thành từ hai đơn vị cơ bản là: malose và amylopectin. Cả hai đều đƣợc cấu tạo từ α-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4- glycoside tạo thành các chuỗi liên tục, ngoài dạng thẳng, amylopectin cịn có cấu trúc phân nhánh và tại điểm phân nhánh là liên kết α-1,6-glycoside. Tỷ lệ phân nhánh là đặc điểm quan trọng của cơ chất vì các enzyme thủy phân cơ chất với tính đặc hiệu khác nhau [35].

Amylase có thể chia làm 3 dạng chính là: α-amylase, β-amylase và glucoamylase. Các enzyme này khác nhau về tính đặc hiệu tác dụng với liên kết glycoside và mợt số tính chất khác.

α-amylase (EC3.2.1.1) có nhiều trong hạt nẩy mầm, tụy tạng, dịch tiếu hóa của đợng vật và trong cả vi khuẩn. α-amylase tḥc nhóm enzyme thủy phân bên trong chuỗi, chúng cắt ngẫu nhiên các liên kết α-1,4-glycoside nằm bên trong phân tử tinh

bột để tạo thành các dextrin phân tử thấp, do đó tinh bợt nhanh chóng bị mất khả năng tạo mầu với Iot và bị giảm độ nhớt mạnh.

α-Amylase là một enzyme ngoại bào đƣợc tạo thành trong tế bào chất và vận chuyển ra ngoài lớp không gian chu chất nhờ các peptide tín hiệu (signal peptide). Đoạn peptide tín hiệu của α-amylase có chiều dài khoảng 29-41 amino acid. Tại vùng NH2 của mỗi đoạn peptide tín hiệu có chứa mợt số vị trí amino acid dễ bị biến đổi, đƣợc nối tiếp với mợt vùng kị nƣớc mạnh có cấu trúc xoắn α.

α-Amylase của nấm men nhƣ S. fibuligera đã đƣợc nghiên cứu gồm 6 trình

tự aixit amin có tính bảo thủ cao nằm trong trung tâm hoạt đợng của enzyme. Axit amin tryptophan tại vị trí 84 (W84) là vùng bảo thủ thứ nhất và sự thay thế nó bởi leucin (L) sẽ làm tăng hoạt tính transglycosylation của nấm nem. Ngoài ra, axit amin tyrosin tại vị trí 83 (Y83) cũng giữ vai trị quan trọng trong sự thủy phân bởi tính bảo thủ cao của nó trong cấu trúc enzyme xuất phát từ nhiều nguồn khác nhau. Sự thay thế Y(83) bởi W, L hoặc N sẽ làm tăng cƣờng hoạt tính transglycosylation mạnh hơn đối với cơ chất maltoheeptoza so với khi thay thế W(84) bởi L [35].

Mỗi phân tử enzyme yêu cầu ít nhất mợt ion Ca2+để duy trì cấu trúc bậc 4 của nó. Khi cho thêm EDTA vào hỗn hợp phản ứng thì chất này sẽ tách io kim loại ra khỏi hỗn hợp phân tử enzyme, do đó làm bất hoạt α-amylase. Hoạt tính của enzyme sẽ đƣợc phục hồi trở lại nếu sau đó hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ với nồng độ Ca2+cao.Ngoài ra Ca2+các ion kim loại khác nhƣ Mg2+cũng cần thiết đối với hoạt động của enzyme. Tuy nhiên khi bất hoạt enzyme sẽ không phôi phục trạng thái hoạt động nếu ủ ở Mg2+. Điều này cho thấy rằng, ion Ca2+rất cần thiết để biểu hiện hoạt tính của emzyme và Ca2+không thể thay thế bằng Mag2+.

1.4. Kỹ thuật Real-time PCR

1.4.1. Tổng quan về Real-time PCR

Trong kỹ thuật PCR truyền thống kết quả của thí nghiệm chỉ đƣợc xác định khi đã hoàn tất các cơng đoạn của thí nghiệm, do đó cơng đoạn PCR thƣờng mất rất nhiều thời gian. Sự ra đời của kỹ thuật Real-time PCR là một bƣớc đột phá trong

công nghệ sinh học. Kỹ thuật này cho phép xác định kết quả của thí nghiệm sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR, chính vì vậy đƣợc gọi là “Real-time”. Kỹ thuật Real-time PCR đƣợc đặc trƣng bởi giới hạn định lƣợng rất rộng, độ nhạy cảm cao đủ để phát hiện một phân tử duy nhất và khả năng lặp lại cao (độ lệch chuẩn nhỏ hơn 0,2 chu kỳ) [6, 7, 18, 35] và phạm vi ứng dụng lớn. Sự ra đời của kỹ thuật Real- time PCR đã cải thiện đáng kể và đơn giản hóa định lƣợng DNA và RNA, kỹ thuật này đã trở thành mợt cơng cụ có giá trị lớn cho ngƣời nghiên cứu, đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử [17, 21, 34]. Các biểu hiện của tất cả các gene trong mợt mẫu có thể đƣợc tạm đánh giá bằng các kỹ thuật microarray. Nhƣng sự biểu hiện của gene đƣợc lựa chọn có thể đƣợc đo với đợ chính xác rất cao bởi Real- time PCR [6, 7]. Đây là phƣơng pháp tốt nhất để xác định số lƣợng của một DNA cụ thể trong một mẫu sinh học phức tạp, hay định lƣợng biểu hiện gen [21, 25]. Phƣơng pháp này đã khắc phục đƣợc hầu hết những thiếu sót và hạn chế lớn của những phƣơng pháp trƣớc đó. Việc sử dụng tính đặc hiệu và đợ nhạy của PCR kết hợp với sử dụng mồi huỳnh quang để phát hiện trực tiếp gene đích, qua đó loại bỏ đƣợc các vấn đề nhƣ: thuốc nhuộm, chuyển màng, lai phóng xạ và thời gian làm thí nghiệm…[3].

Trong kỹ thuật Real-time PCR cả DNA và mRNA đều có thể đƣợc sử dụng làm mẫu thí nghiệm cho Real-time PCR. Nếu sử dụng mRNA làm mẫu phải đƣợc sao chép ngƣợc thành cDNA bằng RT-PCR. Bƣớc phiên mã ngƣợc (reverse transcript) là rất quan trọng quyết định đợ nhạy và tính chính xác khi định lƣợng, vì số lƣợng cDNA đƣợc tạo ra, phải phản ánh mợt cách chính xác số lƣợng đầu vào của mRNA. Kết quả RT có thể khác nhau hơn 100 lần trong các gene đích, sự khác nhau này do cấu trúc mRNA khác nhau, cách dùng mồi (hexamers, oligo (dT) hoặc mồi đặc hiệu của gene), và các đặc tính của enzyme sao mã ngƣợc (dải động, độ hoạt động của RNase và ổn định nhiệt) [6, 21, 31].

Phản ứng phiên mã ngƣợc và realtime có thể thực hiện trong mợt phản ứng RT-PCR, cách này đặc biệt là phù hợp khi phân tích mợt hoặc mợt vài gene và nó cũng giảm nguy cơ đồng nhiễm. Tuy nhiên, tối ƣu điều kiện phản ứng cho phản ứng

sao mã ngƣợc và Real-time PCR thƣờng khác nhau, và khi kết hợp một bƣớc cho phản ứng thƣờng giảm độ nhạy hơn so với phƣơng pháp cách làm hai bƣớc [6, 7]. Khi làm RT-PCR, có thể phát sinh tín hiệu dƣơng tính giả từ DNA trong mẫu. Để tránh vấn đề này mồi PCR để định lƣợng mRNA thƣờng đƣợc thiết kế với chiều dài trên một intron hoặc qua các biên exon [35]. Nếu nhƣ thiết kế thí nghiệm khơng phải xử lý mẫu thì phải đƣợc kiểm tra sự nhiễm mẫu, bằng cách chạy thử một vài mẫu nhƣng không phiên mã ngƣợc, nếu thấy phát tín hiệu là mẫu có thể bị nhiễm và phải xử lý bằng DNase trƣớc khi phiên mã ngƣợc [30]. Thơng thƣờng quy trình thực hiện mợt phản ứng Real-time PCR gồm các bƣớc: chuẩn bị mẫu, tách DNA hoặc RNA, tổng hợp cDNA, thiết kế mồi, cài đặt chƣơng trình cho phản ứng và phân tích kết quả[6, 30].

Chìa khóa làm nên tính ƣu việt của kỹ thuật Real-time PCR là việt sử dụng chất phát huỳnh quang có khả năng bắt vào sản phẩm PCR. Ngày nay, chất phát huỳnh quang đƣợc sử dụng nhƣ là phƣơng pháp phát hiện đặc hiệu trong Real-time PCR. Các huỳnh quang có thể đƣợc chia thành hai loại: loại đặc hiệu và loại không đặc hiệu [36]. Các chất không đặc hiệu nhƣ SYBR Green I và BeBo [5, 38], đây là các chất bắt cặp với đơi sợi DNA, do có ái lực cao với sợi đơi. Đợng học của phản ứng PCR thƣờng đƣợc xác định thông qua sự phát quang của các thuốc nhuộm

DNA. Cơ sở của Realtime-PCR là mối liên hệ thuận giữa tín hiệu thu đƣợc từ thuốc nhuộm với số bản sao của DNA [33].

1.4.2. Phân tích kết quả Real-time PCR

1.4.2.1. Biểu đồ khuếch đại của Real-time PCR (amplification graph) [1]

Biểu đồ khuếch đại có trục tung (Y) là cƣờng đợ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, cịn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt. (hình 1.9), biểu đồ này có thể phân thành các giai đoạn:

“Pha ủ”: Cƣờng độ huỳnh quang trong những chu kỳ đầu sẽ rất thấp và hầu

nhƣ không thay đổi, hiển thị bằng mợt đƣờng thẳng nằm ngang, vì trong giai đoạn này dù DNA đích đã có thể đƣợc nhân bản thành các bản sao nhƣng do số lƣợng chƣa đủ để giúp cho chất phát huỳnh quang nhận đƣợc ánh sáng kích thích phát ra ánh sáng huỳnh quang đủ cƣờng độ để máy ghi nhận.

“Pha log”: khi số lƣợng bản sao của DNA đích đạt đến mợt ngƣỡng nhất định thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ đủ cƣờng độ để đƣợc máy ghi nhận và lúc này chúng ta sẽ thấy đƣờng biểu diễn khuếch đại bắt đầu ngóc lên. Cƣờng đợ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở đi sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lƣợng bản sao của DNA đích tăng gấp đơi sau mỗi chu kỳ. Chúng ta gọi giai đoạn này là “giai đoạn lũy thừa” về cƣờng độ huỳnh quang, không phải là giai đoạn tăng trƣởng lũy thừa về số lƣợng bản sao của DNA đích.

“Pha bình nguyên”: Cƣờng độ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ tăng

trƣởng đến mợt mức nào đó thì đợ tăng trƣởng sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên vì các bản sao của DNA đích, do phản ứng đã cạn dần dNTP và enzyme Taq polymerase khơng hoạt đợng hiệu quả nữa, nên sẽ khơng cịn gia tăng số lƣợng theo cấp số 2 nữa.

Đƣờng biểu diễn khuếch đại (amplification curve) cho chúng ta sẽ thấy một thơng số hết sức quan trọng là chu kì ngƣỡng và biểu đồ nóng chảy.

1.4.2.2. Chu kỳ ngƣỡng (Ct)

Chu kỳ ngƣỡng là trị số đƣợc xác định bằng số chu kỳ mà ở đó đƣợc đƣờng biển diễn khuếch đại cắt đƣờng nền (basal cycle). Cƣờng độ huỳnh quang nền đƣợc thiết bị Real-time PCR ghi nhận cƣờng đợ tín hiệu huỳnh quang trong mợt số chu kỳ đầu và lấy trung bình cợng của các cƣờng độ huỳnh quang này làm cƣờng độ huỳnh quang nền.

Giá trị Ct sớm hay muộn phản ánh số lƣợng bản DNA đích ban đầu do đó thông qua đánh giá so sánh giá trị Ct chúng ta có thể so sánh mợt cách tƣơng đối số lƣợng DNA gốc ở các ống thí nghiệm. Tuy nhiên, vì SYBR Green I bắt cặp cho bất cứ sợi đôi DNA nào xuất hiện trong ống phản ứng sau các chu kỳ nhiệt kể cả các sợi đôi DNA khơng phải DNA đích, do vậy sự xuất hiện đƣờng biểu diễn khuếch đại trong ống phản ứng sẽ không đặc hiệu 100 % cho sự có mặt của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích.

Do đó để phân biệt đƣờng khuyết đại của AND đích với đƣờng khuếch đại của dimer primer ta dựa vào đỉnh nóng chảy.

Hình 1.9: Biểu đồ một đƣờng biểu diễn khuếch đại ghi nhận cƣờng độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận đƣợc ánh sánh kích thích vào mỗi

1.4.2.3. Biểu đồ nóng chảy

Sản phẩm khuếch đại từ dimer primer sẽ khác biệt với sản phẩm DNA đích ở chiều dài, nên có thể phân biệt đƣợc đƣợc đƣờng biểu diễn khuếch đại của ống phản ứng là của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ bản DNA đích hay là từ dimer primer bằng tính chất đặc trƣng đó chính là nhiệt đợ chảy (melting To, Tm), Nhiệt độ chảy của sợi đôi DNA tùy thuộc vào thành phần GC và chiều dài của nó: Thành phần GC càng cao thì Tm càng cao, sợi đơi càng dài thì Tm càng cao. Sản phẩm khuếch đại từ DNA đích dài hơn nên sẽ có Tm cao hơn là Tm của sản phẩm khuếch đại từ dimer primer.

1.4.2.4. Phƣơng pháp so sánh định lƣợng tƣơng đối 2ΔCt

Phản ứng khuếch đại bằng Real-time PCR diễn ra theo cấp số nhân, do đó các mẫu có chu kỳ ngƣỡng chênh nhau 1 đơn vị tƣơng đƣơng với sự khác biệt khoảng 2 lần về hàm lƣợng RNA của gene đích. Tỷ lệ lƣợng RNA giữa mẫu thử và mẫu đối chứng đƣợc tính theo cơng thức:

Tỷ lệ mẫu thử/đối chứng = 2Ct(C)-Ct(T) .

Trong đó, Ct(C) là chu kỳ ngƣỡng của mẫu đối chứng, và Ct(T) là chu kỳ ngƣỡng của mẫu thí nghiệm.

Hình 1.10: Biểu đồ đỉnh nóng chảy cho phép xác định Tm nhờ các đỉnh biểu đồ chảy của từng ống phản ứng

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1. Vật liệu

2.1.1. Chủng vi sinh vật và các gene biến nạp

 Các chủng vi sinh vật:

- Chủng nấm men P. pastoris SMD1168 [ pep4, his4] đã tích hợp pPIC9. - P.pastoris pPIC9 chủng đối chứng – control.

- P. pastoris pPIC9Amy (chủng Amy). - P. pastoris pPIC9IL-2 (chủng IL-2).

 Các gene biến nạp vào các chủng nghiên cứu gồm:

- Gene amy mã hóa cho α-amylase có nguồn gốc từS. Fibuligera.

- Gene IL-2 mã hóa cho interleukin-2có nguồn gốc từ ngƣời.

2.1.2. Mồi cho phản ứng PCR và Real-time PCR

STT Tên mồi Trình tự nucleotide

1 IPP1-Fw 5’-TACGGTGCCTTCCCTCAG-3’ IPP1-Rv 5’-TCCCTCATCCAACAAAGCCATAAC-3’ 2 MF(ALPHA)1-Fw 5’-CTGCAGTTTTATTCGCAGCATCC-3’ MF(ALPHA)1-Rv1 5’-GCAGCAATGCTGGCAATAGTAG-3’ MF(ALPHA)1-Rv2 5’ CTTTTCTCGAGAGATACCCCTTCTTC 3’

2.1.3. Hóa chất, enzyme và các thiết bị máy móc

 Hóa chất:

SDS, Tris-HCL, EDTA (Seava, Đức), isoamylalcohol, chloroform (Roth, Đức), Phenol, EtBr (Ethidium bromide), glycerol, agarose (Gibco, Mỹ), ethanol, agarose (Fluka, Đức), cao nấm men, bactopeptone, dNTPs (Promega, Mỹ), MgSO4, Magnessium chloride, Calcium chloride, Sodium hydroxide, Sodium chloride, acetic acid, hóa chất trong bợ kít tinh sạch DNA (Qiagen, Đức), DEPC, IPTG, polyacrylamide. Hóa chất trong bợ tách chiết và tinh sạch mRNA tổng số của hãng QiAgen, Bợ kít Real time-PCR light cyler 2.0 one step của hãng Roche.

 Enzyme:

Taq-DNA Polymerase, (Biolabs, Anh), DNaseI, RNase (Fermentas, Mỹ), lysoyme, Potassium acetate (Qiagen, Đức).

 Máy móc và thiết bị:

Máy Real-time PCR trên máy LightCycler của Roche version 2.0; máy PCR (MJ Research, Mỹ); máy ly tâm lạnh (Sorvall RC5B, Mỹ); bể ổn nhiệt (Memmert, Mỹ); máy điện di, máy chiếu tia cực tím (Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ); máy ly tâm ống nhỏ (Sorvall, Mỹ) và máy đo pH (Metler, Thụy Sỹ).

2.1.4. Phần mềm

Phần mềm LightCycler 4.0.

2.1.5. Các loại môi trƣờng và dung dịch

a. Môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc và biểu hiện gene ngoại lai trong tế bào nấm menP. pastoris

- Môi trƣờng MD lỏng: 1,34% yeast nitrogen base (YNB); 4x10-5% biotin; 2% dextrose (glucose).

- Môi trƣờng MD đặc: 1,34% yeast nitrogen base (YNB); 4x10-5% biotin; 2% dextrose (glucose), 1.5% agar.

- Môi trƣờng BMGY: 1% cao nấm men, 2% peptone,100 mM potassium phosphate, pH 6,0; 1,34% YNB; 4x10-5 % biotin; 1% glycerol.

- Môi trƣờng BMMY: 1% cao nấm men, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate, pH 6,0; 1,34% YNB; 4x10-5 % biotin; 1% methanol,.

b. Dung dịch tách chiết mRNA từ nấm men

- Dung dịch BY1 gồm có 1M sorbitol, 0.5M EDTA có bổ sung thêm 0.1% mercaptoethanol và zymolase tới nồng đợ cuối cùng là 300 µg/ml.

- Dung dịch RLT theo bộ kit đƣợc sử dụng để phá thành tế bào và đƣợc bổ sung 1% mercaptoethanol trƣớc khi sử dụng.

- Dung dịch RPE đƣợc bổ sung ethanol theo tỉ lệ 1 RPE: 3 Ethanol đƣợc sử dụng để làm sạch mẫu tách chiết.

c. Dung dịch xử lý DNA lẫn trong các mẫu RNA tách chiết

- Dung dịch EDTA 25mM.

- Dung dịch DEPC 1%: Pha DEPC trong nƣớc đến nồng độ 1% để loại bỏ toàn bợ RNase trong nƣớc, sau đó đem khử trùng dung dịch để loại bỏ DEPC.