1.3.1. Phƣơng pháp quang phổ
Để định lượng nicotin trong một số nghiên cứu ở nước ngoài đã sử dụng phương pháp định lượng trực tiếp với axit barbituric (C4H4O3N2) và diethylthiobarbituric dựa trên cơ sở phản ứng Konig: nicotin chuyển hóa thành cotinin sẽ tạo màu da cam đặc trưng với axit barbituric và màu đỏ với diethylthiobarbituric. Đo ở bước sóng 510nm. Phương pháp này đơn giản, rẻ
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
trưng hồn tồn với cotinin, nó có thể xảy ra với các hợp chất khác có cấu trúc vịng pyridine cùng có mặt trong các mẫu chứa nicotin. Ngưỡng phát hiện của phương pháp cao (40 μg/L) khơng thích hợp cho việc giám sát sinh học đối với công nhân tiếp xúc trong môi trường sản xuất thuốc lá.
1.3.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp
Đây là phương pháp thường được sử dụng. Phương pháp sử dụng cột silicagen để thực hiện việc tách, sử dụng hỗn hợp dichlometan làm pha động. Rửa giải với tốc độ 0,7 mL/phút và được xác định bằng detector UV ở bước sóng 259nm. Đây là phương pháp đáng tin cậy nhưng lượng dung môi sử dụng cho phân tích lớn.
1.3.3. Phƣơng pháp sắc ký khí
Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký khí là dựa trên sự tách các cấu tử có trong mẫu giữa 2 pha. Pha động (khí mang): các loại khí mang thường được sử dụng trong sắc ký khí là Argon, Heli, Nito, Hydro có độ tinh khiết cao. Pha tĩnh: tồn tại ở hai dạng: dạng rắn trong sắc ký khí rắn và dạng lỏng trong sắc ký khí lỏng. Pha tĩnh đóng vai trị chính trong việc tạo nên những tương tác cần thiết để các cấu tử tách khỏi nhau. Pha tĩnh không được phản ứng bất thuận nghịch với khí mang và cấu tử cần phân tích.
Trong sắc ký khí, mẫu phân tích phân bố vào khí mang và qua cột chứa pha tĩnh. Các quá trình tách chất được thực hiện trên cột khi có hàng chục ngàn các cân bằng động xảy ra trên cột. Tùy thuộc vào đặc tính lý hóa của mỗi cấu tử mà khi đi qua cột các cấu tử có thể được tách nhanh hay chậm. Mỗi chất sau khi tách ra khỏi cột lần lượt đi vào detectơ và được detectơ ghi lại thành tín hiệu gọi là píc. Thời gian từ lúc bắt đầu bơm mẫu cho đến lúc xuất hiện cực đại của píc tín hiệu được gọi là thời gian lưu của mỗi chất trong cột sắc ký. Thời gian lưu này sẽ cung cấp những thơng tin về định tính, thành phần chất có trong mẫu. Diện tích của píc tỷ lệ với lượng chất có trong mẫu. Việc xác định và tính tốn độ lớn của các píc là thước đo định lượng cho từng
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
chất có trong hỗn hợp mẫu cần nghiên cứu [20].
Nguyên lý làm việc của máy sắc ký khí
Hình 1.13. Sơ đồ khối thiết bị sắc ký khí
1 - Nguồn khí mang 7 - Bộ phận khuyếch đại 2 - Điều chỉnh áp 8 - Máy ghi
3 - Lọc khí 9 - Máy tích phân
4 - Bộ phận bơm mẫu 10 - Hệ điều khiển và computer 5 - Cột tách 11 - Buồng điều nhiệt
6 - Detectơ
Ngun lý hoạt động: Khí mang từ bình chứa khí hoặc máy phát khí đi
qua đồng hồ giảm áp vào bộ phận lọc khí rồi đi vào buồng bay hơi mẫu. Dưới tác dụng của nhiệt độ, mẫu được bay hơi hồn tồn. Sau đó, mẫu được khí mang đưa vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra ở cột và được gọi là quá trình tách các chất. Sau khi các chất được tách, chúng lần lượt ra khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, nhờ khí mang các cấu tử lần lượt đi vào detector và được phát hiện tại đây, tín hiệu sau đó được truyền vào bộ khuyếch đại. Các tín hiệu được mang sang bộ ghi hoặc máy tính để xử
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
Cột tách sắc ký khí: Trong thiết bị sắc ký thì cột tách sắc ký là bộ phận
quan trọng nhất. Cột tách sắc ký có thể là cột nhồi hoặc cột mao quản. Ngày nay, có rất nhiều loại cột khác nhau về bản chất, đường kính và chiều dài cột. Tùy theo các hợp chất cần phân tích và mục đích sử dụng mà ta có thể lựa chọn từng loại cột tách cho phù hợp. Các loại cột tách được sử dụng trong sắc ký:
- Cột nhồi được làm bằng thép không gỉ hoặc thủy tinh có đường kính từ 0,53 đến 4mm, và có chiều dài từ 0,5 đến 6m.
- Cột mao quản có đường kính trong nhỏ từ 0,25 đến 0,53mm và chiều dài từ 5 đến 100m được chế tạo bằng thủy tinh, silica. Do cấu tạo như vậy nên cột mao quản có số đĩa lý thuyết rất cao và khả năng tách cao.
Trong thực tế, có nhiều dạng cột tách khác nhau nhằm thỏa mãn các mục đích nghiên cứu. Nói chung, cột tách sắc ký cần đạt được các yêu cầu sau: Đảm bảo trao đổi chất giữa pha động và pha tĩnh; độ thấm tách cao; khả năng tải trọng cao của cột; khoảng nhiệt độ sử dụng lớn, làm việc được ở nhiệt độ cao.
Detectơ: Hiện nay, có rất nhiều loại detectơ khác nhau phù hợp với
từng chất phân tích như detectơ cộng kết điện tử (ECD), detectơ quang hóa ngọn lửa (FPD), detectơ ion hóa ngọn lửa (FID), detectơ dẫn nhiệt (TCD), detectơ nitơ photpho (NPD), detectơ khối phổ,… Đối với phương pháp sắc ký khí thì detectơ được sử dụng phổ biến là loại detectơ FID. Hầu như khơng có thiết bị sắc ký khí nào lại không được trang bị detectơ này, FID là loại detector tốt để xác định các hợp chất hydrocacbon dễ bay hơi có trọng lượng phân tử vừa và nhỏ. Nhờ sự đa dạng về cột tách và detectơ mà ngày nay phương pháp sắc ký khí trở nên rất linh động, mở ra khả năng ứng dụng lớn trong nghiên cứu khoa học và ứng dụng thực tiễn [27].
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
CHƢƠNG 2.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng và đặc trƣng vùng lấy mẫu nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng được chọn là Nicotin trong khơng khí nơi sản xuất thuốc lá và khu vực xung quanh; trong máu người làm trong môi trường sản xuất thuốc lá và người hút thuốc lá.
a, Mẫu khơng khí được lấy ở nơi sản xuất thuốc lá và khu vực xung quanh Nhà máy thuốc lá Thăng Long, Quận Thanh Xuân, Hà Nội:
- Các phân xưởng sản xuất thuốc lá của Nhà máy thuốc lá Thăng Long, 335 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội.
- Viện kinh tế Kỹ thuật thuốc lá, 335 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội.
- Hai bên đường Nguyễn Trãi, khu vực 332 và 336 Nguyễn Trãi.
- Khuân viên Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội.
Tổng số mẫu khí được lấy để nghiên cứu là 25 mẫu.
b, Người lao động không hút thuốc lá và làm việc trực tiếp tại Nhà máy thuốc lá Thăng Long; số đối tượng được chọn nghiên cứu là 42 người (n = 42; 12 nam, 30 nữ). Những người được chọn nghiên cứu có độ tuổi trong khoảng từ 42 đến 54, có thâm niên cơng tác từ 24 đến 34 năm, làm việc tại các bộ phận của nhà máy thuốc lá Thăng Long: Phân xưởng Bao cứng, Phân xưởng Bao mềm, Phân xưởng Sợi, phòng Nguyên liệu và phòng Tiêu thụ. Mẫu máu được lấy chủ yếu là mẫu máu của người lao động làm việc tại Phân xưởng Bao mềm (chiếm 66,7%) là do Phân xưởng Bao mềm là phân xưởng có quy mơ lớn nhất
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
Bên cạnh đó luận văn đã tập trung nghiên cứu nicotin có trong mẫu máu của 29 bệnh nhân điều trị tại viện Y học Cổ truyền Quân đội; các bệnh nhân này là những người hút thuốc lá và những người làm trong môi trường sản xuất thuốc lá, đã có những biểu hiện bệnh lý của việc nhiễm độc nicotin như các biểu hiện về tim mạch, hô hấp, các bệnh về da…
Các mẫu máu được Viện Y học Cổ truyền Quân đội thực hiện theo chương trình hợp tác nghiên cứu giữa Viện với Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
2.1.2. Đặc trƣng vùng nghiên cứu
Nhà máy thuốc lá Thăng Long có vị trí ở Phường Thanh Xuân Trung, chất lượng môi trường khơng khí tại khu vực chịu ảnh hưởng bởi các hoạt động sản xuất cả bên trong và bên ngoài.
Điều kiện khí tượng vùng nghiên cứu
- Khí hậu: thuộc khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm đặc trưng, mùa hè nóng
ẩm và mưa nhiều, mùa đơng lạnh khơ và mưa ít.
- Bức xạ tổng cộng trung bình hàng năm ở Hà Nội: 122,8 kcal/cm2 và nhiệt độ khơng khí trung bình hàng năm là 23,6ºC.
- Độ ẩm trung bình năm: 84,5%.
- Lượng mưa: Lượng mưa trung bình hàng năm là 1.245mm và mỗi năm có khoảng 114 ngày mưa. Từ tháng 5 đến tháng 9 là mùa nóng và mưa (lượng mưa 682mm/năm). Từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau là thời tiết khô ráo. Xen giữa hai thời kỳ này giai đoạn chuyển tiếp tháng 4, tháng 10.
- Chế độ gió: Gió Đơng Nam là gió thịnh hành trong năm tại khu vực
Hà Nội. Các tháng có tần suất gió Đông Nam lớn là tháng 3, 4, 5 đạt trên 40%, trong đó tháng 4 đạt tới 47%, các tháng mùa Đơng tần suất này có giảm đi nhưng vẫn trên 15%. Gió Đơng Bắc và gió Đơng cũng có tần suất xuất hiện lớn. Các tháng giữa mùa đơng, tần suất gió Đơng Bắc đều trên 20%. Hướng
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
gió Đơng xuất hiện nhiều vào tháng 4, 5 đạt 15-16%. Như vậy có thể hướng dịng khí đến Hà Nội chủ yếu là từ Đông sang Tây. Tốc độ gió trung bình khơng lớn, tháng có tốc độ gió trung bình thấp nhất là tháng 1 (khoảng 1,5m/s), còn lớn nhất là vào tháng 4 (khoảng 2,5 m/s).
Vào mùa đơng, nhất là vào những đợt xuất hiện gió mùa Đơng Bắc, Hà Nội thường xảy ra hiện tượng nghịch nhiệt. Nói nghịch nhiệt vì trong lớp khơng khí vài trăm mét gần mặt đất nhiệt độ khơng khí tăng theo độ cao, khác với diễn biến thông thường là nhiệt độ càng lên cao càng giảm [11].
Những yếu tố khí tượng trên đều có ý nghĩa quyết định đối với sự lan truyền và biến đổi các chất ơ nhiễm trong khí quyển.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trên cơ sở tìm hiểu về đối tượng cần nghiên cứu; tìm hiểu về cơ sở lý thuyết các phép phân tích; tìm hiểu và tổng hợp các tài liệu nghiên cứu có liên quan lựa chọn các phương pháp nghiên cứu phù hợp.
Với đối tượng nghiên cứu là nicotin trong mơi trường khơng khí và nicotin trong máu, lựa chọn phương pháp sắc ký khí với detectơ cộng kết điện tử (GC/ECD) và phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), phương pháp chiết lỏng - lỏng là các phương pháp chính sử dụng trong nghiên cứu. Các phương pháp lựa chọn này cho hiệu suất và độ thu hồi cao, ngưỡng phát hiện thấp, quy trình đơn giản; thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thông dụng ở các phịng thí nghiệm tại Việt Nam hiện nay.
2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS)
Phương pháp sắc ký khí khối phổ là kỹ thuật kết hợp cột phân chia sắc ký với detector là detector khối phổ. Sau khi đi qua cột tách, nicotin được ion hóa bằng phương pháp hóa học bởi khí NH3 hoặc izobutan. Dịng ion hóa tối ưu là 300µA, năng lượng chùm điện tử là 70eV. Nhiệt độ nguồn 250ºC, nhiệt độ bề mặt tiếp xúc là 280ºC. Các ion được lựa chọn tối ưu trong phân tích
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
Sử dụng nội chuẩn nicotin đơterit hóa trị 3. Phương pháp cho độ nhạy gấp 10 lần só với trước đây sử dụng ion hóa trực tiếp bằng dịng điện phát ra khi đốt nóng filamen-dây đốt thơng thường làm từ Wolfram, ở nhiệt độ cao [28].
2.2.2. Phƣơng pháp sắc ký khí detectơ cộng kết điện tử (GC/ECD)
Detectơ này hoạt động dựa trên đặc tính của các chất có khả năng cộng kết các điện tử tự do trong pha tĩnh (trừ trường hợp ngoại lệ của các khí trơ). Khả năng cộng kết điện tử lớn hay nhỏ là phụ thuộc vào cấu trúc của các hợp chất cần được phát hiện.
Để xác định nicotin trong khơng khí thường sử dụng detectơ cộng kết điện tử (ECD).
Định tính: Trên sắc đồ nhận được các píc tương ứng với các tín hiệu
của các chất, trong đó có nicotin. Mỗi píc trên sắc đồ ứng với một chất, người ta sử dụng yếu tố đặc trưng là thời gian lưu của píc để nhận diện nicotin. Bằng việc so sánh thời gian lưu của cấu tử cần xác định với thời gian lưu của chất chuẩn có thể kết luận được tên chất. Việc nhận diện một chất có chính xác hay khơng phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nhưng yếu tố đầu tiên là sự giống nhau của mẫu phân tích so với mẫu chuẩn, và chỉ được khẳng định khi thời gian lưu của chất cần xác định trùng với giá trị thời gian lưu của chất chuẩn.
Định lượng: Xác định định lượng nicotin trong khơng khí dựa vào
đường chuẩn. Đường chuẩn được xây dựng trên cơ sở mối tương quan giữa nồng độ chất chuẩn với số đếm diện tích píc tương ứng của nó. Từ kết quả phân tích mẫu thu được và phương trình hồi quy của đường chuẩn có thể xác định được nồng độ chất cần xác định.
Khi so sánh sắc đồ của mẫu với các sắc đồ chất chuẩn có thể định tính, định lượng được thành phần các chất có trong mẫu. Độ tin cậy của kết quả phân tích sắc ký phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, như thiết bị sắc ký khí (đặc biệt là cột tách và detectơ) và trình độ kĩ thuật của người phân tích.
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
2.2.3. Phƣơng pháp chiết lỏng - lỏng
Chiết lỏng - lỏng được sử dụng để chiết nicotin ra khỏi dung dịch hấp thụ NaHSO4 1%. Trong bước này cần chọn dung mơi chiết thích hợp để chuyển chất cần xác định từ mẫu phân tích sang dung mơi chiết. Có nhiều loại dung mơi khác nhau có thể được lựa chọn để chiết mẫu, dung môi được lựa chọn phải có độ hồ tan tốt các chất cần xác định và đạt được hiệu suất chiết chất cao nhất.
Để lựa chọn dung môi chiết nicotin ra khỏi mẫu khơng khí, người ta dựa vào tính chất hóa lý của dung môi và các chất cần thiết. Nicotin là một chất tan trong nước, tan mạnh trong dung mơi hữu cơ, hút ẩm và có thể trộn lẫn với nước ở dạng bazơ. Là một bazơ gốc nitơ, nicotin tạo ra các muối với các axít và hịa tan tốt trong nước.
Trên cơ sở các đặc tính hóa lý của một số loại dung môi, đề tài chọn n- hexan làm dung môi chiết nicotin ra khỏi dung dịch hấp thụ NaHSO4 1%. n- Hexan là dung môi không tan trong nước, nhẹ hơn nước.
2.3. Các phƣơng pháp lấy mẫu 2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu khí 2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu khí
- Sử dụng máy lấy mẫu khí cá nhân Kimoto của Nhật để lấy mẫu ngồi khơng khí. Máy được đặt ở độ cao đồng nhất cách mặt đất 1,5m.
- Điểm lấy mẫu được bố trí ở nơi trống, thống gió từ mọi phía, khoảng cách giữa các điểm lấy mẫu với các vật cản (nhà cao tầng, cây cao…) đảm bảo cho góc tạo thành giữa đỉnh của vật cản với điểm đo và mặt nằm ngang không lớn hơn 30 độ.
- Số lượng mẫu, sự phân bố các điểm lấy mẫu trong khu vực quan tâm được xác định theo các yêu cầu cụ thể nhưng khơng ít hơn 3 mẫu cho mỗi điểm đo.
Luận văn Thạc sĩ Bùi Thị Kiều Trang
- Dung dịch hấp thụ là dung dịch NaHSO4 1% 20mL - Thời gian lấy mẫu là 1 giờ.
2.3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu máu
Mẫu máu được Viện Y học Cổ truyền Quân đội lấy từ người lao động trong Nhà máy Thuốc lá Thăng Long và những bệnh nhân điều trị bệnh tại Viện Y học Cổ truyền Quân đội. Hầu hết những người này làm việc tại Nhà máy thuốc lá Thăng Long đến điều trị bệnh và được cho uống thuốc loại bỏ nicotin ra khỏi cơ thể.
Mẫu máu được tiến hành lấy theo đúng quy định của Bộ Y tế về việc