Phân tích ADN từ xương người

Chƣơng 1 TỔNG QUAN

1.3. Cấu tạo xƣơng, răng ngƣời và cơ sở để phân tích ADN xƣơng, răng

1.3.2. Phân tích ADN từ xương người

1.3.2.1. Cơ sở khoa học để có thể phân tích ADN từ xương người

Giống như các bộ phận khác trên cơ thể, trong xương có những tế bào sống mang đầy đủ ADN, làm nhiệm vụ liên kết, ni dưỡng và duy trì cấu trúc xương. Đặc biệt ở các xương dài, xương cột sống và răng còn có tủy sống chứa một lượng lớn tế bào, đủ để có thể tiến hành phân tích ADN.

1.3.2.2. Các xương được ưu tiên trong phân tích ADN

Theo nghiên cứ u của tiến sĩ Timothy McMahon khi phân tích 5946 mẫu hài cốt có thời gian trên 50 năm thì kết quả phân tích ADN ty thể ta ̣i các vi ̣ trí khác nhau của bơ ̣ xương được thể hiê ̣n trong Hình 1.3. Theo đó sẽ lựa cho ̣n phần xương để tiến hành thí nghiệm theo tiêu chí:

- Phần xương tớt nhất cho viê ̣c phân tích ADN: xương đùi. - Phần dễ thu thâ ̣p nhất: răng (răng hàm).

Hình 1.3. Tỉ lệ thành cơng khi phân tích ADN ti thể tại các vị trí xương khác nhau trên cơ thể người [29]

1.3.2.3. Cấu tạo xương dài và cơ sở phân tích ADN

Đối với các xương dài, ở 2 đầu xương, lớp xương đặc chỉ còn là một lớp mỏng bao bọc ngoài và bên trong là cả khối xương xốp chứa đầy tủy đỏ. Các bè xương ở đây xếp theo nhiều hướng khác nhau tạo thành những hốc nhỏ chứa tủy đỏ. Còn ở phần thân xương, lớp xương chắc, đặc ở ngoài làm thành một ống xương dày ở giữa, và mỏng dần ở 2 đầu; lớp xương xốp ở trong thì ngược lại, mỏng ở giữa và dày dần ở 2 đầu; trong cùng là một ống tủy dài chứa đầy tủy vàng. Các bè xương ở đây cuộn lại thành ống sắp theo chiều dọc của xương tạo thành các trụ xương. Giữa trụ xương có ống rỗng (ống Have) chứa thần kinh và mạch máu. Các trụ xương lại được liên kết với

Hình 1.4. Cấu tạo xương dài

Chính các tế bào nằm sâu trong xương là cơ sở để tiến hành phân tích ADN từ xương dài.

1.3.2.4. Cấu tạo răng hàm và cơ sở phân tích ADN

Mỗi răng có phần thân răng và chân răng. Giữa phần thân răng và chân răng là đường cổ răng là một đường cong, còn gọi là đường nối men-xê măng. Thân răng được bao bọc bởi men răng, chân răng được xê măng bao phủ.

Răng hàm bao gồm men, ngà răng (mô cứng) và tủy răng (mô mềm):

- Men răng là lớp ngoài cùng có độ dầy mỏng tùy theo mặt răng. Mặt nhai của răng hàm có độ dầy nhiều nhất (từ 1mm-3mm), răng cửa có men mỏng nhất. Men răng không có màu và trong suốt, nên màu răng là màu của ngà. Men răng không có dây thần kinh cảm giác nên men răng không biết đau. Men răng có nguồn gốc ngoại bì, là tổ chức cứng nhất cơ thể là tổ chức có tỉ lệ muối vô cơ cao nhất trong các tổ chức rắn của cơ thể (96% là muối vô cơ).

- Ngà răng là tổ chức chiếm khối lượng chủ yếu ở thân răng, trong điều kiện bình thường ngà răng khơng lộ ra ngồi, và được bao phủ hồn toàn bởi men răng và xương răng. Ngà răng bao bọc và bảo vệ cho tủy răng. Ngà là tổ chức ít rắn hơn và chun giãn hơn men răng, khơng giịn và dễ vỡ như men răng. Do cấu tạo bên trong, giữa các tế bào ngà có những ống nhỏ chứa dây thần kinh và mạch máu nên ngà răng có cảm giác đau, nóng lạnh, chất chua ngọt, và hơi gió lạnh.

- Tủy răng gồm buồng tủy và ống tủy chân răng. Buồng tủy là trung tâm điểm của răng, chứa mạch máu và dây thần kinh để nuôi răng. Mạch máu dẫn từ trong xương và đi vào răng từ dưới gốc răng, qua lổ chóp chân răng. Đây cũng là nơi mang nhiều tế bào nhất trong răng, cực kì quan trọng trong phân tích ADN.

Dựa vào cấu ta ̣o , những răng càng có nhiều chân răng thì lượng ADN có trong răng càng nhiều, chính vì thế ưu tiên lựa chọn răng hàm có từ 2 – 3 chân răng.

1.3.2.5. Ưu điểm và nhược điểm của việc phân tích ADN nhân tế bào từ răng, xương * Ưu điểm:

Việc phân tích được ADN nhân tế bào từ răng, xương có giá trị vô cùng to lớn trong việc truy nguyên cá thể, hơn hẳn so với việc phân tích ADN ty thể.

Răng và xương rất khó bị phân hủy trong điều kiện thường, và gần như vẫn giữ được nguyên vẹn ngay cả khi tồn bộ cơ thể đã phân hủy. Chính vì thế, với những xác

sót lại có giá trị để truy ngun. Chính vì thế nên việc phân tích ADN nhân tế bào từ răng, xương là bắt buộc trong nhiều vụ án.

* Nhược điểm:

Việc thu và bảo quản mẫu là rất khó khăn, cần đến những người có chuyên môn như bác sĩ pháp y.

Việc tách chiết và phân tích ADN nhân tế bào từ răng, xương phức tạp, khó khăn và lâu hơn rất nhiều so với các mẫu tế bào bình thường.

1.3.3. Cơ sở để sử dụng bộ kit PrepFiler® trong việc tách chiết ADN từ hài cốt để phục vụ giám định ADN trong khoa học hình sự

Với đặc điểm của hài cốt là có hàm lượng ADN thấp, nằm sâu bên trong xương, khó có thể tách bằng phương pháp thông thường nên dựa vào những ưu điểm của bộ kit PrepFiler® có thể kỳ vọng việc sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách ADN từ hài cốt là có hiệu quả.

Bộ kit PrepFiler® hiện nay đã được đưa vào quy trình tách chiết theo thơng tư số 46/2013/TT-BCA nên có thể ứng dụng một cách hợp pháp ngay lập tức trong các vụ án, khơng như các bộ kit khác, muốn sử dụng cịn phải trải qua phê duyệt, kiểm tra, rất tốn thời gian. Chính vì thế, nếu tách được ADN từ hài cốt nhờ bộ kit PrepFiler® thì có thể sử dụng ngay trong công tác giám định ADN của Viện Khoa học hình sự.

1.4. Các bộ kit khác có thể sử dụng để tách chiết ADN từ mẫu răng, xƣơng

1.4.1. QIAamp Investigator DNA Kit

Hãng sản xuất: Qiagen.

Đối tượng sử dụng: các mẫu xương, mẫu tóc, móng tay, kẹo cao su, phết trên bề mặt hiện trường, bàn chải đánh răng, dao cạo râu...

Sử du ̣ng công nghê ̣ cô ̣t silicas để tách chiết ADN , có thể sử dụng đối với các mẫu xương còn mới nhưng chưa có nghiên cứu cu ̣ thể về hiê ̣u quả tách chiết đối với

mẫu xương lâu năm ta ̣i Viê ̣t Nam . Và hiện tại bộ kit này chưa được đưa vào quy trình tách chiết tại Viện Khoa học hình sự – Bơ ̣ Cơng an.

1.4.2. PrepFiler® BTA Forensic DNA Extraction Kit

Hãng sản xuất: Life Technologies™. Đối tượng sử dụng: các mẫu xương, răng.

Sử du ̣ng ha ̣t từ tính (Magnetic Particles) để tách ADN , cho kết quả tốt trong viê ̣c phân tích răng , xương và đã được sử du ̣ng ta ̣i Viê ̣n Khoa ho ̣c hình sự – Bô ̣ Công an. Tuy nhiên bộ kit này có giá thành rất cao , so vớ i bô ̣ kit PrepFiler® thì giá thành cao gấp 10 lần.

Ở các nước ơn đới như Cơng hịa Séc, Nga… các hài cốt được tìm thấy thường cịn rất tốt, thậm chí có những hài cốt vài trăm năm nhưng chất lượng vẫn còn hơn hài cốt vài chục năm ở Việt Nam, nên việc tách chiết và phân tích ADN nhân tế bào từ răng xương không gặp nhiều khó khăn như ở Việt Nam. Nếu sử dụng bộ kit PrepFiler® BTA Forensic DNA Extraction thì phải thực hiện vài lần mới có thể phân tích được ADN từ hài cốt nên sẽ rất tốn kém. Chính vì thế việc nghiên cứu để sử dụng bộ kit PrepFiler® cho tách chiết ADN thu đươ ̣c từ hài cốt tại Việt Nam là cần thiết.

Qua nghiên cứu tài liê ̣u cả trong và ngoài nước , chúng tơi chưa thấy có cơng trình nào đề c ập một cách đầy đủ , chi tiết về việc sử dụng bộ kit PrepFiler® cho tách chiết ADN thu đươ ̣c từ hài cốt của những vu ̣ án hình sự tại Việt Nam. Xuất phát từ những thực tế đó, trước yêu cầu giám đi ̣nh hài cốt trong lĩnh vực hình sự , đề tài được thực hiện nhằm tìm ra phương pháp tối ưu để tách chiết ADN nhân tế bào một cách hiệu quả nhất từ những hài cốt trong các vụ án hình sự ở Viê ̣t Nam. Trên cơ sở đó xây dựng quy trình chi tiết tách chiết ADN nhân tế bào ở hài cốt phu ̣c vụ cho công tác giám định ADN ta ̣i Viê ̣n Khoa học hình sự - Bộ Cơng an.

Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Là các mẫu răng và xương được thu thập trực tiếp từ các vụ án thực tế, với thời gian trong khoảng từ 1 - 10 năm, được chia làm 2 nhóm từ 1 - 2 năm và từ 2 - 10 năm. Ưu tiên lựa chọn các mẫu có mẫu so sánh (nghi ngờ là thân nhân của người chết, thường là cha, mẹ, con hoặc anh em…) để kiểm chứng lại kết quả. Gồm có 12 mẫu thuộc 06 bộ hài cốt (mỗi bộ hài cốt thu 01 mẫu răng và 01 mẫu xương):

- 03 mẫu răng của thi thể chết dưới 2 năm. - 03 mẫu răng của thi thể chết từ 2 -10 năm.

- 03 mẫu xương của thi thể chết dưới 2 năm (xương được chọn là xương đùi). - 03 mẫu xương của thi thể chết từ 2 - 10 năm (xương được chọn là xương đùi). Nội dung các vụ án thực tế:

1. Khoảng 21 giờ ngày 03/4/2015 tại khu vực đồi Khuổi Luông thuộc thôn Thươ ̣ng Mỹ, xã Việt Vinh , huyê ̣n Bắc Quang , tỉnh Hà Giang phát hiện 01 tử thi đang trong tình tra ̣ng phân hủy ma ̣nh . Khám nghiệm hiện trường đánh giá sơ bộ nạn nhân chết trong khoảng 3 tháng trở lại đây. Thu giữ 01 răng hàm và 01 đoạn xương đùi để tiến hành giám định.

2. Hồi 7 giờ 15 phút ngày 08/01/2015, gia đình ơng Đ tại bản Pù Lầu, xã Xuân Nha, huyện Vân Hồ, tỉnh Sơn La bị cháy. Tại hiện trường phát hiện một xác người đã bị cháy gần hết . Cơ quan CSĐT Công an tỉnh Sơn La tổ chức khám nghiê ̣m , điều tra và thu giữ 01 răng hàm và 01 đoạn xương đùi để tiến hành giám định.

3. Ngày 12/5/2015, Cơ quan CSĐT – Công an tỉnh Nam Định tổ chức khám nghiệm một tử thi nam giới chết chưa rõ nguyên nhân, tung tích tại Chân Cầu S2 thuộc xóm 6, xã Thành Lợi, huyện Vụ Bản, tỉnh Nam Định. Thu giữ 01 răng hàm và 01 đoạn xương đùi để tiến hành giám định.

Hình 2.1. Mẫu răng, xương có thời gian dưới 02 năm

4. Hồi 10 giờ ngày 12/01/2015 tại bãi Bồi sông Hồng thuô ̣c xã Yên Mỹ, Thanh Trì, Hà Nội đã phát hiện một xác người chết đã phân hủy hết (chưa rõ lai li ̣ch ). Khám nghiệm hiện trường đánh giá sơ bộ nạn nhân đã chết khoảng 3 năm. Thu giữ 01 răng hàm và 01 đoạn xương đùi để tiến hành giám định.

5. Ngày 07/4/2015 tại thơn Nậm Sị, xã Bản Phiệt, huyện Bảo Thắng, tỉnh Lào Cai đã phát hiện một bộ hài cốt, cơ quan CSĐT Công an tỉnh Lào Cai đã khám nghiệm hiện trường và thu giữ 01 hàm và 01 đoạn xương đùi để tiến hành giám định.

6. Hồi 8 giờ ngày 06/4/2015, Công an huyện Mường Khương, tỉnh Lào Cai nhận được tin báo về việc phát hiện một bộ hài cốt trong hang đá thuộc thôn Na Pên, thị trấn Mường Khương, huyện Mường Khương, tỉnh Lào Cai. Công an huyện Mường Khương đã tiếp nhận và tiến hành điều tra xác minh. Thu giữ 01 chiếc răng hàm và 01 đoạn xương đùi gửi giám định.

2.2. Dụng cụ và hố chất thí nghiệm

2.2.1. Dụng cụ thí nghiệm

2.2.1.1. Thiết bị máy móc

- Máy chu trình nhiệt ABI – 9700 (Mỹ).

- Máy giải trình tự gen 3130 Genetic Analyzer của hãng ABI - Mỹ sử dụng phần mềm của hãng Hitachi - Nhật bản.

- Máy ly tâm siêu tốc Universal 320 và Micro 200R của CH Liên Bang Đức có vận tốc ly tâm tối đa là 15.000v/phút.

- Máy Eco™ Real-Time PCR System của hãng Illumina – Mỹ.

- Máy điều nhiệt 9700 của hãng ABI - Mỹ phục vụ chạy phản ứng PCR. - Block heater của hãng Selby - Australia, gồm 2 loại: đơn và đôi. - Máy điều nhiệt (Eppendorf - Đức).

- Máy mài xương cầm tay. - Tủ sấy (Đức), tủ lạnh (Nhật).

- Block gia nhiệt.

- Máy cất nước hai lần (Trung Quốc). - Máy nghiền xương bằng Nitơ lỏng (Mỹ). 2.2.1.2. Dụng cụ thí nghiệm thường dùng

- Pipet định mức, tuýp Eppendoft. - Giá từ tính Magnetic (ABI - Mỹ).

2.2.2. Hóa chất thí nghiệm

- Bộ kit PrepFiler® Forensic DNA Extraction (Hãng Life Technologies™, Mỹ). - Proteinase K 50 µg/µl (ABI, Mỹ).

- Dithiothreitol 1,0 M (ABI, Mỹ).

- Kit Human DNA Quantification dùng cho định lượng bằng phương pháp Real time PCR (Hãng Life Technologies™, Mỹ).

- AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit (hãng Hãng Life Technologies™, Mỹ).

- Nước Javen, cồn 90%, Isopropanol, …

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp làm sạch mẫu

Sau khi các mẫu được thu thập, tiến hành làm sạch cơ học bằng bàn chải, giấy nhám, máy mài xương cầm tay hoặc cưa sắt để loại bỏ phần xương mục cũng như các chất bám trên bề mặt răng, xương.

Sử du ̣ng 01 chiếc răng hoặc một lượng xương nặng khoảng 2g, sử dụng cưa cắt thành từng mảnh nhỏ. Đưa mẫu răng (hoặc xương) vào ống Falcon 50ml và rửa một lần bằng dung dịch javen 5% (lưu ý: không để quá lâu trong javen, nếu để quá lâu sẽ làm hỏng mẫu). Sau đó lắc trong nước cất 5 - 7 lần (mỗi lần lắc khoảng 1 phút) tùy chất lượng mẫu. Cuối cùng lắc trong cồn 90% rồi lấy ra để khô trong điều kiện nhiệt độ phòng.

Khử trùng mẫu bằng phương pháp chiếu tia UV trong 15 phút. Sau đó có thể nghiền mẫu ngay hoặc cất mẫu trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng.

2.3.2. Phương pháp nghiền mẫu

Răng, xương được nghiền trong nitơ lỏng bằng máy nghiền chuyên dụng. Bột răng, xương thu được bảo quản trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng.

2.3.3. Phương pháp tách chiết ADN bằng bợ kit PrepFiler®

Quy trình tách chiết ADN của bộ kit PrepFiler® được hãng khuyến cáo sử dụng được trình bày trong mục 1.2.4 của luận văn. Thí nghiệm đầu tiên được tiến hành theo đúng quy trình của hãng sản xuất đối với 50 mg bột răng (xương) có thời gian dưới 02 năm để đánh giá kết quả. Lần lượt tiến hành các thí nghiệm với sự thay đổi hóa chất ủ mẫu, thời gian ủ mẫu và các bước tiến tách chiết.

Tiến hành 10 thí nghiệm trên 12 mẫu (6 mẫu răng và 6 mẫu xương) được chia thành 2 nhóm: hài cốt có thời gian dưới 02 năm và hài cốt có thời gian từ 2 – 10 năm, mỗi thí nghiệm đều có mẫu đối chứng âm (chỉ có hóa chất thí nghiệm) và được tiến hành thí nghiệm song song cùng với mẫu để kiểm tra có bị nhiễm trong quá trình tách chiết hay khơng.

Đối với nhóm hài cốt có thời gian dưới 02 năm, do trong xương các tế bào rất khó bị phân hủy nên các thí nghiệm sẽ lần lượt bổ sung thêm 5µl, 7µl, 10µl Proteinase K 50 µg/µl (ABI, Mỹ) với hoạt độ phân giải 20UI/mg và thay đổi thời gian ủ lên 6, 10, 14 giờ để tăng khả năng phân hủy tế bào trong xương, từ đó tăng khả năng thu được ADN từ bột răng, xương. Các bước tách chiết sau đó được giữ nguyên như quy trình chuẩn. Các thay đổi cụ thể được nêu như Bảng 2.1.

Đối với nhóm hài cốt có thời gian từ 02 – 10 năm, các thí nghiệm sẽ tăng lượng bột xương từ 50 mg, 100 mg, 150 mg và thay đổi lượng hóa chất tương ứng. Các bước tách chiết sau đó cũng được thay đổi cho phù hợp. Cụ thể các thay đổi được nêu trong

Quy trình của hãng Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Thí nghiệm 3 Thí nghiệm 4 Thí nghiệm 5 Bƣớc 1 Xác định lƣợng mẫu sử dụng Mẫu dịch: 40µl. Mẫu vật mang: 25 mm2 50 mg bột răng, xương từ hài cốt 1. 50 mg bột răng,