So sánh kết quả phân tích ADN ở các mẫu hài cốt

Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.4. So sánh kết quả phân tích ADN ở các mẫu hài cốt

Trong 12 mẫu răng xương thuộc 6 bộ hài cốt được tiến hành thí nghiệm thì có 10 mẫu thuộc 05 bộ hài cốt có mẫu so sánh, là những người nghi ngờ có mối quan hệ huyết thống trực hệ với hài cốt, Còn 02 mẫu thuộc 02 bộ hài cốt thì khơng có mẫu so sánh.

Kết quả so sánh kiểu gen thu được từ 12 mẫu:

- Các mẫu đối chứng âm đều cho kết quả âm tính, chứng tỏ quy trình tách chiết khơng bị nhiễm ADN.

- 12 mẫu này thuộc 06 bộ hài cốt khác nhau, các mẫu cùng thuộc một bộ hài cốt có kiểu gen hoàn toàn trùng nhau.

- 05 bộ hài cốt (Bộ hài cốt số 1,2,3,4 và 5) có quan hệ huyết thống trực hệ với 05 mẫu so sánh tương ứng.

Kết quả này chứng tỏ phương pháp tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt bằng bộ kit PrepFiler® là hồn tồn có thể tin cậy để sử dụng,

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã góp phần giải quyết ki ̣p th ời yêu cầu thực tiễn đă ̣t ra với công tác giám đi ̣nh ADN ta ̣i Viê ̣n Khoa học hình sự - Bộ Công an, viê ̣c đưa ra quy trình chi tiết cho tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt và ứng du ̣ng trực tiếp quy trình giám đi ̣nh vào các vu ̣ án thực tế cho thấy đề tài đã hoàn thành tốt mu ̣c tiêu đề ra và ứng du ̣ng trực tiếp vào thực tiễn ta ̣i phịng thí nghiệm Viện Khoa học hình sự - Bộ Cơng an.

Bảng 3.3. So sánh kiểu gen của mẫu R1, X1, R2, X2 với mẫu so sánh tƣơng ứng

Locus gen

KiÓu gen

R1 X1 Mẫu so sánh 1 R2 X2 Mẫu so sánh 2 D8S1179 15; 17 15; 17 15; 18 14; 17 14; 17 14 D21S11 29; 31 29; 31 29 30;32,2 30;32,2 30; 32,2 D7S820 10; 11 10; 11 10; 13 8; 14 8; 14 11; 14 CSF1PO 10; 12 10; 12 12 11; 12 11; 12 11 D3S1358 17; 19 17; 19 17; 18 16; 17 16; 17 16; 17 TH01 7; 8 7; 8 8; 10 9 9 8; 9 D13S317 11 11 11; 13 8; 11 8; 11 8; 12 D16S539 10; 13 10; 13 10 12 12 12; 14 D2S1338 19 19 19; 22 17; 19 17; 19 19; 22 D19S433 13 13 13; 15 13; 14 13; 14 13; 14 vWA 19 19 19; 21 17; 19 17; 19 17 TPOX 8 8 8 11 11 8; 11 D18S51 12; 15 12; 15 12; 16 14; 21 14; 21 14; 16 D5S818 7; 10 7; 10 10 10; 13 10; 13 7; 10 FGA 21 21 21; 23 20; 25 20; 25 18; 20 AMEL XY XY XX XY XY XY

Bảng 3.4. So sánh kiểu gen của mẫu R3, X3, R4, X4 với mẫu so sánh tƣơng ứng

Locus gen

Kiểu gen

R3 X3 Mẫu so sánh 3 R4 X4 Mẫu so sánh 4

D8S1179 16 16 15; 16 13; 14 13; 14 13; 15 D21S11 31,2;33,2 31,2;33,2 30; 31,2 30;32,2 30;32,2 30 D7S820 10; 12 10; 12 12 11 11 11; 12 CSF1PO 10; 12 10; 12 10; 11 10; 11 10; 11 10; 11 D3S1358 16; 18 16; 18 16 17; 18 17; 18 17 TH01 8; 9 8; 9 9 7; 9 7; 9 7; 8 D13S317 8; 12 8; 12 8; 9 9 9 9; 10 D16S539 9; 11 9; 11 11; 12 9 9 9; 10 D2S1338 19 19 19; 22 24 24 24 D19S433 11; 15,2 11; 15,2 11; 13 15;15,2 15;15,2 15; 17 vWA 17 17 17 17; 20 17; 20 17; 21 TPOX 10 10 8; 10 8 8 8; 12 D18S51 14; 15 14; 15 14; 23 13; 16 13; 16 13; 14 D5S818 7; 12 7; 12 7; 12 10; 13 10; 13 13; 15 FGA 22; 24 22; 24 22 21;23,2 21;23,2 21 AMEL XY XY XY XY XY XX

Bảng 3.5. So sánh kiểu gen của mẫu R5, X5, R6, X6 với mẫu so sánh tƣơng ứng

Locus gen

Kiểu gen

R5 X5 Mẫu so sánh 5 R6 X6 Mẫu so sánh

D8S1179 11; 12 11; 12 11; 12 14; 15 14; 15 D21S11 29; 31 29; 31 30; 31 29;33,2 29;33,2 D7S820 9; 11 9; 11 11 8; 13 8; 13 CSF1PO 10; 12 10; 12 10 12; 13 12; 13 D3S1358 15; 17 15; 17 15; 16 15 15 TH01 8; 9 8; 9 9 9; 9,3 9; 9,3 D13S317 9; 10 9; 10 8; 9 10; 12 10; 12 D16S539 11; 12 11; 12 9; 12 9; 12 9; 12 D2S1338 17; 19 17; 19 17; 23 21; 23 21; 23 D19S433 13; 16,2 13; 16,2 13; 15,2 12; 13 12; 13 vWA 17; 18 17; 18 17; 19 18; 20 18; 20 TPOX 11 11 8; 11 8 8 D18S51 12; 16 12; 16 13; 16 14; 21 14; 21 D5S818 10 10 10 11; 14 11; 14 FGA 22; 23 22; 23 19; 23 24; 26 24; 26 AMEL XY XY XY XY XY

3.5. Quy trình tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt bằng bộ kit PrepFiler®

Sau khi tiến hành nghiên cứu, luận văn đưa ra quy trình tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt bằng bộ kit PrepFiler® trong các vụ án hính sự như sau:

QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ADN NHÂN Tế BÀO TẾ BÀO TỪ HÀI CỐT

1. Làm sạch mẫu:

- Tiến hành làm sạch cơ học bằng nước cất, bàn chải, giấy nhám, máy mài xương cầm tay hoặc cưa sắt để loại bỏ phần răng bị sâu, xương bị mục cũng như các chất bẩn bám trên bề mặt răng, xương.

- Lấy một lượng xương khoảng 2g cắt thành từng mảnh nhỏ hoặc 1 chiếc răng đã làm sạch, đưa vào ống Falcon 50 ml chứa Javen 10%, lắc đều trong 30 giây rồi loại bỏ nước Javen (lưu ý: không để quá lâu trong javen, nếu để quá lâu sẽ làm hỏng mẫu). Sau đó lắc trong nước cất (5 đến 7 lần tùy chất lượng mẫu). Cuối cùng lắc trong cồn 90% rồi lấy ra để khơ tự nhiên trong điều kiện bình thường.

- Sử dụng phương pháp khử trùng, diệt vi khuẩn bằng tia UV trong 15 phút. Sau đó có thể nghiền mẫu ngay hoặc cất mẫu trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng.

2. Nghiền mẫu:

Có thể làm 1 trong 2 cách sau:

Nghiền răng, xương trong nitơ lỏng bằng máy nghiền chuyên dụng.

Nghiền răng, xương bằng các thao tác cơ học thông thường. Sử dụng chày và cối bằng inox không gỉ.

Bột răng, xương thu được cất vào tủ lạnh cho đến khi sử dụng.

3. Tách chiết ADN bằng bộ kit PrepFiler®:

A. Đối với mẫu hài cốt có thời gian dưới 02 năm:

Bƣớc 1. Ủ mẫu với lysis Buffer:

Lắc ống Enpendoft trong 5 giây, sau đó ly tâm trong vài giây để hóa chất được trộn đều với nhau. Bọc ống Enpendoft bằng paraphin để tránh bị bật nắp trong khi lắc ủ. Để ống Enpendoft chứa mẫu vào máy lắc nhiệt, ủ ở 560C với tốc độ 900 rpm đến sáng hôm sau (12 - 14 giờ).

Bƣớc 2. Loại bỏ cơ chất:

Tắt máy lắc nhiệt, lấy ống Enpendoft ra để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, loại bỏ paraphin và đưa ống Enpendoft vào máy ly tâm (ly tâm 13000 vòng trong 3 phút).

Hút phần dịch nổi bên trên chuyển sang ống Enpendoft khác để tiến hành bước 3 (lưu ý: không được hút phần bột răng, xương). Phần bột răng xương còn lại có thể bỏ đi hoặc giữ lại cho các thí nghiệm khác.

Bƣớc 3. Gắn ADN với các hạt từ tính (Magnetic Particlec)

Lắc tuýp Prepfiler Magnetic Particlestrong 5 giây (lật ngược tuýp để chắc chắn rằng không có hạt từ vón cục ở đáy tuýp). Hút 15 µl hạt từ tính cho vào ống Enpendoft chứa dịch nổi thu được từ bước 2.

Lắc ống Enpendoft ở tốc độ chậm (500 đến 1200 vòng/phút) trong 10 giây để hạt từ tan đều trong dung dịch. Bổ sung thêm 180 µl Isopropanol rồi tiếp tục lắc ở tốc độ chậm 500 đến 1200 vòng/phút trong vài giây (nếu có hiện tượng sủi bọt thì phải thêm Isopropanol), sau đó ly tâm trong vài giây để đảm bảo không có hạt từ bám bên trên thành ống Enpendoft.

Lắc ống Enpendoft trên bằng máy lắc ở nhiệt độ phòng trong 10 phút với tốc độ 1000 vòng/phút.

Bƣớc 4. Rửa ADN liên kết với hạt từ

Lấy ống Enpendoft ra khỏi máy lắc, ly tâm vài giây để không có hạt từ bám bên trên thành ống Enpendoft.

Đưa ống Enpendoft vào giá từ và chờ từ 1 - 2 phút để hạt từ chuyển hết về thành ống phía giá từ. Lấy pipet hút và loại bỏ hết phần chất lỏng nhìn thấy được (không hút hạt từ).

Tiếp theo thực hiện bước này 3 lần:

a. Thêm 300 µl Prepfiler Wash Buffer vào ống Enpendoft chứa hạt từ. b. Lấy ống Enpendoft ra khỏi giá từ và lắc tốc độ cao để hạt từ tan trong dung dịch Prepfiler Wash Buffer, khi khơng cịn hạt từ bám trên thành ống Enpendoft thì ly tâm trong vài giây.

d. Đưa ống Enpendoft vào giá từ khoảng 1 - 2 phút.

e. Dùng pipet hút và loại bỏ hết phần dịch lỏng nhìn thấy được.

Bƣớc 5. Thu ADN

Sau khi rửa hạt từ bằng Prepfiler Wash Buffer 3 lần, mở nắp ống Enpendoft và để khơ trong 10 phút. Khi hạt từ đã khơ hồn tồn, thêm 30 µl Prepfiler Elution Buffer. Lắc ống Enpendoft để hạt từ tan vào dung dịch Prepfiler Elution Buffer nhưng phải đảm bảo không có hạt từ nào bám vào thành tuýp, sau đó đưa ống Enpendoft vào máy lắc nhiệt (ủ 560C với tốc độ 900 rpm trong 5 phút).

Sau 5 phút lấy ống Enpendoft ra khỏi máy máy lắc nhiệt, lắc nhẹ và li tâm vài giây để khơng cịn hạt từ nào bám dính vào thành ống Enpendoft, sau đó đưa ống Enpendoft vào giá từ khoảng 1 phút.

Hút phần chất lỏng chứa ADN (khơng hút hạt từ) vào ống Enpendoft mới. Tồn bộ ADN thu được chứa trong ống cuối cùng này có thể sử dụng cho các bước tiếp theo hoặc bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh đến khi sử dụng.

B. Đối với mẫu hài cốt có thời gian từ 02 - 10 năm:

Bƣớc 1. Ủ mẫu với lysis Buffer:

Chuyển 150 mg bột xương (hoặc răng) vào 03 ống Enpendoft 1,5 ml (mỗi ống chứa 50 mg). (*)

Lắc các ống Enpendoft trong 5 giây, sau đó ly tâm trong vài giây để hóa chất được trộn đều với nhau. Bọc các ống Enpendoft bằng paraphin để tránh bị bật nắp trong khi lắc ủ. Để các ống Enpendoft chứa mẫu vào máy lắc nhiệt, ủ ở 560C với tốc độ 900 rpm đến sáng hôm sau (12 - 14 giờ).

Bƣớc 2. Loại bỏ cơ chất:

Tắt máy lắc nhiệt, lấy các ống Enpendoft ra, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, loại bỏ paraphin và đưa các ống Enpendoft vào máy ly tâm (ly tâm 13000 vòng trong 3 phút).

Hút phần dịch nổi bên trên chuyển sang 3 ống Enpendoft khác để tiến hành bước 3 (lưu ý: không được hút phần bột răng, xương). Phần bột răng xương còn lại có thể bỏ đi hoặc giữ lại cho các thí nghiệm khác.

Bƣớc 3. Gắn ADN với các hạt từ tính (Magnetic Particlec)

Lắc tuýp Prepfiler Magnetic Particles trong 5 giây (lật ngược tuýp để chắc chắn rằng không có hạt từ vón cục ở đáy tuýp). Hút 15 µl hạt từ tính cho vào mỗi ống Enpendoft chứa dịch nổi thu được từ bước 2.

Lắc các ống Enpendoft ở tốc độ chậm (500 đến 1200 vòng/phút) trong 10 giây để hạt từ tan đều trong dung dịch. Bổ sung thêm 180 µl Isopropanol vào mỗi ống rồi tiếp tục lắc ở tốc độ chậm (500 đến 1200 vòng/phút) trong vài giây (nếu có hiện tượng sủi bọt thì phải thêm Isopropanol), sau đó ly tâm trong vài giây để đảm bảo không có hạt từ bám bên trên thành ống Enpendoft.

Lắc các ống Enpendoft trên bằng máy lắc ở nhiệt độ phòng trong 20 phút với tốc độ 1000 vòng/phút. (*)

Bƣớc 4. Rửa ADN liên kết với hạt từ

Lấy các ống Enpendoft ra khỏi máy lắc, ly tâm vài giây để không có hạt từ bám bên trên thành ống Enpendoft.

Đưa các ống Enpendoft vào giá từ và chờ từ 1 - 2 phút để hạt từ chuyển hết về thành ống phía giá từ. Lấy pipet hút và loại bỏ hết phần chất lỏng nhìn thấy được (khơng hút hạt từ).

Tiếp theo thực hiện bước rửa 3 lần: Lần 1:

a. Thêm 300 µl Prepfiler Wash Buffer vào mỗi ống Enpendoft chứa hạt từ. b. Lấy ống Enpendoft ra khỏi giá từ và lắc tốc độ cao để hạt từ tan trong dung dịch Prepfiler Wash Buffer, khi khơng cịn hạt từ bám trên thành ống Enpendoft thì ly tâm trong vài giây.

c. Đưa ống Enpendoft vào giá từ khoảng 1 - 2 phút.

d. Dùng pipet hút và loại bỏ hết phần dịch lỏng nhìn thấy được. Lần 2: (*)

a. Thêm 600 µl Prepfiler Wash Buffer vào ống Enpendoft thứ nhất, trộn đều để hạt từ tan vào dung dịch Prepfiler Wash Bufferm. Sau đó hút toàn bộ đưa vào ống thứ 2, tiếp tục mix cho hạt từ tan đều rồi hút tất cả cho vào ống cuối cùng.

b. Lấy ống Enpendoft ra khỏi giá từ và lắc tốc độ cao để hạt từ tan trong dung dịch Prepfiler Wash Buffer, khi khơng cịn hạt từ bám trên thành ống Enpendoft thì ly tâm trong vài giây.

c. Đưa ống Enpendoft vào giá từ khoảng 2 phút.

d. Dùng pipet hút và loại bỏ hết phần dịch lỏng nhìn thấy được. Lần 3: (*)

a. Thêm 600 µl Prepfiler Wash Buffer vào ống Enpendoft chứa hạt từ. b. Lấy ống Enpendoft ra khỏi giá từ và lắc tốc độ cao để hạt từ tan trong dung dịch Prepfiler Wash Buffer, khi khơng cịn hạt từ bám trên thành ống Enpendoft thì ly tâm trong vài giây.

Bƣớc 5. Thu ADN

Sau khi rửa hạt từ bằng Prepfiler Wash Buffer 3 lần, mở nắp ống Enpendoft và để khô trong 10 phút. Khi hạt từ đã khơ hồn tồn, thêm 60 µl Prepfiler Elution Buffer. (*)

Lắc ống Enpendoft để hạt từ tan vào dung dịch Prepfiler Elution Buffer nhưng phải đảm bảo không có hạt từ nào bám vào thành tuýp, sau đó đưa ống Enpendoft vào máy lắc nhiệt (ủ 560C với tốc độ 900 rpm trong 5 phút).

Sau 5 phút lấy ống Enpendoft ra khỏi máy máy lắc nhiệt, lắc nhẹ và li tâm vài giây để khơng cịn hạt từ nào bám dính vào thành ống Enpendoft, sau đó đưa ống Enpendoft vào giá từ khoảng 1 phút.

Hút phần chất lỏng chứa ADN (không hút hạt từ) vào ống Enpendoft khác, đưa ngay ống Enpendoft này vào máy ly tâm (ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút) rồi hút phần chất lỏng chứa ADN (không hút hạt từ) vào ống Enpendoft mới. Toàn bộ ADN thu được chứa trong ống cuối cùng này có thể sử dụng cho các bước tiếp theo hoặc bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh đến khi sử dụng.

Ghi chú:

- (*): là những bước đã được thay đổi so với quy trình gốc của nhà sản xuất. - Quy trình này dành riêng cho tách chiết ADN nhân tế bào từ các mẫu răng, xương của hài cốt có thời gian dưới 10 năm sau khi chết (gồm 2 quy trình cho 2 nhóm hài cốt có thời gian dưới 02 năm và từ 02 năm đến 10 năm sau khi chết).

- Tồn bộ quy trình thực hiện được hồn tất và cho kết quả trong vòng 02 ngày:

Sáng ngày thứ nhất: Làm sạch mẫu.

Chiều ngày thứ nhất: Nghiền mẫu và ủ mẫu qua đêm. Sáng ngày thứ hai: Tách chiết, thu ADN và tiến hành PCR. Chiều ngày thứ hai: Điện di và phân tích kết quả.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:

1. Bước đầu ứng dụng bộ kit Prepfiler® tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt có thời gian dưới 10 năm để phục vụ công tác giám định ADN hình sự tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Cơng an.

2. Hiệu quả tách chiết ADN nhân tế bào bằng bộ kit Prepfiler® từ các mẫu răng và xương là tương tự nhau.

Kiến nghị:

1. Khuyến cáo cán bộ khám nghiệm tử thi chỉ cần thu 1 – 2 chiếc răng hàm để phục vụ công tác giám định (do mẫu răng dễ thu, dễ bảo quản, niêm phong và vận chuyển).

2. Tiếp tục tiến hành nghiên cứu ứng dụng bộ kit Prepfiler® để tách chiết ADN từ các mẫu hài cốt có thời gian trên 10 năm.

3. Mở rộng nghiên cứu ứng dụng các bộ kit tách chiết ADN khác để tách chiết ADN từ các mẫu hài cốt nhằm chủ động trong công tác giám định ADN tại Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1. Nguyễn Văn Hà (2011), Nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN ti thể từ răng, xương người phục vụ giám định ADN ti thể trong điều kiện Việt Nam, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ, Viện Khoa học hình sự, Tổng cục cảnh sát phịng chống tội phạm, Bộ Cơng an.

2. Hoàng Tử Hùng (2010), Giải phẫu răng, NXB Y học. 3. Hồng Tử Hùng (2010), Mơ phôi răng miệng, NXB Y học.

4. Hà Quốc Khanh, Nguyễn Văn Hà (2007), Giám định ADN, Viện khoa ho ̣c hình sự,