Định lượng sản phẩm ADN sau tách chiết

Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.4. Định lượng sản phẩm ADN sau tách chiết

Chất lượng và số lượng của ADN tách chiết sẽ được xác định bằng phương pháp Realtime PCR, sử dụng bộ kit Quantifiler® Human DNA và phân tích trên máy Eco™ Real-Time PCR System (hãng Illumina – Mỹ) để định lượng ADN tổng số từ mẫu được tách chiết. Mục tiêu đích là hTERT (Human telomerase reverse transcriptase gene) tại vị trí 5p15.33, chiều dài khuếch đại là 62 bp và vùng khuếch đại là vùng intron.

Bộ kit gồm:

- Quantifiler PCR Reaction Mix: Nguyên liệu cho phản ứng PCR.

- Quantifiler Human PrimerMix: gồm mồi xuôi, mồi ngược để khuếch đại đoạn gen; Probe phát hiện đích; chất kiểm chứng.

- Quantifiler Human DNA Standard: DNA chuẩn đã được tinh sạch với nồng độ 200ng/µl.

Mẫu chứng chuẩn được pha loãng với nồng độ thích hợp và tiến hành định lượng cùng mẫu trên máy Eco™ Real-Time PCR System (hãng Illumina – Mỹ).

Bảng 2.3. Nồng độ mẫu chứng khi Realtime PCR

Chứng chuẩn S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 Nồng độ

(ng/µl)

50.000 16,700 5,560 1,850 0,620 0,210 0,068 0,023

Kết quả phân tích thu được đường chuẩn của mẫu chứng thì mới được chấp nhận để sử dụng. Kết quả được thống kê thành file exel

Hình 2.1. Ảnh kết quả Realtime PCR trên máy Eco™ Real-Time PCR System (hãng Illumina – Mỹ)

2.3.5. Nhân bội sản phẩm ADN sau tách chiết bằng phản ứng PCR

Sau khi mẫu ADN được định lượng, tiến hành thực hiện phản ứng PCR, sử dụng bộ kit AmpFlSTR® Identifiler®. Bộ kit Identifiler có 16 locus gen bao gồm các locus sau: CSF1PO, D2S1338, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11, FGA, TH01, TP0X, wWA và Amelogenin (giới tính). Các gen này sẽ được nhân lên trong phản ứng PCR.

Mẫu sau khi được định lượng sẽ được tính toán để đưa vào phản ứng PCR với hàm lượng 1 ng trên thể tích 5µl. Thành phần của 1 phản ứng PCR gồm:

Bảng 2.6. Thành phần của phản ứng PCR sử dụng bộ kit Identifiler

Thành phần Thể tích (µl) AmpFlSTR PCR Reaction Mix 5,25 AmpliTaq Gold ADN Polymarase 0,25 AmpFlSTR Identifiler Primer Set 2,75

Mẫu + nước 5 Tổng 12,5

Hỗn hợp phản ứng được chạy trên máy PCR ABI- 9700 (Mỹ) với chu trình nhiệt như sau:

Bảng 2.7. Chu trình nhiệt đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR

Nhiệt độ Thời gian (phút) Số chu kỳ

95oC 11 1 94oC 1 28 59oC 1 72oC 1 60oC 60 1 4oC ∞ 1

2.3.6. Điện di và phân tích kết quả

Sau khi chạy phản ứng PCR để nhân bội các đoạn STR theo bộ kit Identifiler, tiến hành điện di trên máy giải trình tự gen ABI Prism 3130 Genetic Analyzer và phân tích kết quả bằng phần mềm GeneMapper ID v.3.2.

Chuẩn bị mẫu trước khi điện di: Ngoài các mẫu là đối tượng nghiên cứu, chúng tôi chuẩn bị thêm hỗn hợp phản ứng cho thang alen chuẩn. Thành phần và tỷ lệ thể tích từng hỗn hợp phản ứng cho mẫu hoặc thang alen như sau:

Bảng 2.8. Thành phần của hỗn hợp điện di trên máy ABI 3130

Thành phần Thể tích (µl) Hi-DiTM Formamide 8,7 GeneScan™ 500 LIZ® 0,3 Mẫu/Thang alen chuẩn 1,5 Tổng 10,5 Hỗn hợp phản ứng được biến tính ở 95o

C trong vịng 3 phút, sau đó lấy ra và ủ ngay vào ngăn đá trong 2 phút. Quá trình biến tính và làm lạnh đột ngột này đảm bảo hầu hết ADN từ dạng mạch đơi sẽ chuyển hồn tồn sang dạng mạch đơn và làm giảm tỉ lệ bắt cặp trở lại.

Cuối cùng hỗn hợp được tiến hành điện di trên máy giải trình tự gen ABI Prism

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả định lƣợng sản phẩm ADN sau tách chiết 3.1. Kết quả định lƣợng sản phẩm ADN sau tách chiết

Sau khi định lượng ADN bằng phương pháp Realtime PCR, sử dụng bộ kit Quantifiler® Human DNA và phân tích trên máy Eco™ Real-Time PCR System (hãng Illumina – Mỹ) kết quả được thống kê chi tiết tại Bảng 3.1 và 3.2.

Bảng 3.1. Kết quả định lƣợng ADN tổng số từ thí nghiệm 1 đến thí nghiệm 5 đối với các mẫu hài cốt có thời gian dƣới 02 năm

STT Tên mẫu Lần 1 Hàm lượng ADN (ng/µl) Lần 2 Lần 3 Trung

bình Sai số

1 Thí nghiệm 1 – Răng số 1 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

0,023 0,037 0,029 0,030 0,005

2 Thí nghiệm 1 – Xương số 1 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

0,030 0,025 0,035 0,030 0,003

3 Thí nghiệm 2 – Răng số 1 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

0,457 0,442 0,496 0,465 0,021

4 Thí nghiệm 2 – Xương số 1 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

0,394 0,443 0,484 0,440 0,031

5 Thí nghiệm 3 – Răng số 1 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

1,025 1,142 0,998 1,055 0,058

6 Thí nghiệm 3 – Xương số 1 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

1,094 0,983 1,184 1,087 0,069

7 Thí nghiệm 4 – Răng số 1 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

1,124 1,134 1,212 1,157 0,037

8 Thí nghiệm 4 – Xương số 1 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

1,154 1,034 1,125 1,104 0,047

9 Thí nghiệm 5 – Răng số 2 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

1,125 1,041 0,928 1,031 0,069

10 Thí nghiệm 5 – Xương số 2 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

1,192 0,923 1,224 1,113 0,127

11 Thí nghiệm 5 – Răng số 3 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

1,115 1,152 1,028 1,098 0,047

12 Thí nghiệm 5 – Xương số 3 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

1,154 0,953 1,085 1,064 0,074

Dựa trên kết quả định lượng từ thí nghiệm 1 đến thí nghiệm 5 đối với các mẫu hài cốt có thời gian dưới 02 năm từ Bảng 3.1 có thể nhận xét:

- Các mẫu đối chứng âm đều cho kết quả định lượng bằng 0 ng/µl chứng tỏ quá trình tiến hành thí nghiệm khơng bị nhiễm.

- Trong cùng một thí nghiệm thì mẫu răng và xương cho kết quả xấp xỉ như nhau.

- Thí nghiệm 1 thu được lượng ADN rất thấp (0,030 ± 0,005 ng/µl) chứng tỏ việc sử dụng đúng quy trình hãng khuyến cáo khơng hiệu quả đối với mẫu răng xương.

- Sự thay đổi hàm lượng ADN qua các thí nghiệm được biểu diễn qua hình 3.1.

Hình 3.1. So sánh kết quả định lượng ADN tổng số từ thí nghiệm 1 đến thí nghiệm 4 đối với mẫu hài cốt có thời gian dưới 02 năm (răng số 1 và xương số 1)

- Hàm lượng ADN tăng qua các thí nghiệm chứng tỏ việc bổ sung thêm Proteinase K và tăng thời gian ủ là có hiệu quả. Thí nghiệm 3 và thí nghiệm 4 có sự chênh lệch không nhiều chứng tỏ tăng thêm Proteinase K và tăng thời gian ủ như thí nghiệm 4 khơng làm tăng thêm lượng ADN thu được. - Thí nghiệm 5 thu được hàm lượng ADN ở mức cao chứng tỏ việc bổ sung

Bảng 3.2. Kết quả định lƣợng ADN tổng số từ thì nghiệm 6 đến thí nghiệm 10 đối với các mẫu hài cốt có thời gian từ 02 – 10 năm

STT Tên mẫu Lần 1 Hàm lượng ADN (ng/µl) Lần 2 Lần 3 Trung

bình Sai số

1 Thí nghiệm 6 – Răng số 4 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

0,439 0,457 0,459 0,452 0,008 2 Thí nghiệm 6 – Xương số 4 Đối chứng âm Mẫu 0,399 0 0,452 0 0,457 0 0 0

0,436 0,025 3 Thí nghiệm 7 – Răng số 4 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

0,479 0,458 0,422 0,453 0,021 4 Thí nghiệm 7 – Xương số 4 Đối chứng âm Mẫu 0,411 0 0,378 0 0,399 0 0 0

0,396 0,012 5 Thí nghiệm 8 – Răng số 4 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

0,548 0,604 0,624 0,592 0,029 6 Thí nghiệm 8 – Xương số 4 Đối chứng âm Mẫu 0,544 0 0,598 0 0,610 0 0 0

0,584 0,027 7 Thí nghiệm 9 – Răng số 4 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

0,824 0,847 0,798 0,823 0,017 8 Thí nghiệm 9 – Xương số 4 Đối chứng âm Mẫu 0,821 0 0,820 0 0,757 0 0 0

0,799 0,028 9 Thí nghiệm 10 – Răng số 5 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

0,844 0,846 0,788 0,826 0,025 10 Thí nghiệm 10 – Xương số 5 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

0,851 0,830 0,797 0,826 0,019 11 Thí nghiệm 10 – Răng số 6 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

0,888 0,866 0,798 0,851 0,035 12 Thí nghiệm 10 – Xương số 6 Đối chứng âm Mẫu 0 0 0 0 0

0,871 0,850 0,812 0,844 0,022

Dựa trên kết quả định lượng từ thí nghiệm 5 đến thí nghiệm 10 đối với các mẫu hài cốt có thời gian từ 02 - 10 năm từ Bảng 3.2 có thể nhận xét:

- Các mẫu đối chứng âm đều cho kết quả định lượng bằng 0 ng/µl chứng tỏ quá trình tiến hành thí nghiệm khơng bị nhiễm.

- Trong cùng một thí nghiệm thì mẫu răng và xương cho kết quả xấp xỉ như nhau.

- Sự thay đổi hàm lượng ADN qua các thí nghiệm được biểu diễn qua hình 3.2.

Hình 3.2. So sánh kết quả định lượng ADN tổng số giữa thí nghiệm 3,6,7,8 và 9 - Cùng quy trình tách chiết nhưng hàm lượng ADN thu được ở thí nghiệm 3

cao gấp 2,5 lần thí nghiệm 6, chứng tỏ việc tách chiết ADN từ mẫu răng, xương từ 02 – 10 năm khó khăn hơn việc tách chiết ADN từ mẫu răng, xương dưới 02 năm.

- Hàm lượng ADN thu được ở thí nghiệm 6 và 7 xấp xỉ nhau chứng tỏ tăng gấp đôi lượng răng, xương không giúp thu được nhiều ADN hơn.

- Hàm lượng ADN tăng qua các thí nghiệm 8 và 9 chứng tỏ việc tăng thêm ống ủ xương đã có hiệu quả.

3.2. Kết quả điện di đối với các mẫu răng và xƣơng có thời gian dƣới 2 năm

3.2.1. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 1

Thí nghiệm đã thu được ADN, tuy rất ít nhưng đã chứng tỏ rằng có thể tách được ADN từ răng và xương bằng phương pháp này.

Hình 3.3. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 1 - răng số 1

- Kết quả điện di không thu được alen nào do hàm lượng ADN thu được quá thấp, tế bào trong răng và xương vẫn chưa bị phá hủy hoàn toàn, cần có sự thay đổi trong quá trình ủ mẫu (quá trình quyết định để thu lấy ADN). Tiến hành bổ sung thêm 5 µl proteinase K 50 µg/µl (ABI, Mỹ) với hoạt độ 20UI/mg (gấp 5 lần lượng proteinase K thường được sử dụng để tách tế bào) và tăng thời gian ủ lên 6 giờ để tăng khả năng phá hủy tế bào trong răng và xương.

3.2.2. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 2

Hình 3.4. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 2 - răng số 1

- Kết quả điện di đã thu được alen ở 9 locus gen, tuy nhiên cịn có đỉnh bị lỗi, chiều cao đỉnh chỉ từ 32 đến 120 (rfu) và số lượng locus bị mất vẫn còn nhiều (8/16 locus tương ứng với 50%). Kết quả này đã là bước tiến đáng kể, chứng tỏ có thể tách được ADN nhân tế bào từ răng, xương bằng bộ kit PrepFiler®,

3.2.3. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 3

Hình 3.5. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 3 - xương số 1

- Kết quả điện di đã thu được đầy đủ alen ở tất cả các locus gen, số lượng đỉnh bị lỗi ít. Kết quả này cho thấy kiểu gen phân tích được đủ cơ sở để truy nguyên cá thể.

- Chất lượng ADN đã đảm bảo, không có locus nào bị mất alen, chiều cao các đỉnh đạt mức chấp nhận được cho truy nguyên cá thể. Tuy nhiên, nếu được bổ sung thêm proteinase K và thời gian ủ được tăng thêm thì chất lượng ADN thu được có tiếp

tục tăng khơng? Để trả lời câu hỏi này, thí nghiệm 4 được bổ sung 10 µl proteinase K 50 µg/µl (ABI, Mỹ) với hoạt độ 20UI/mg và tăng thời gian ủ lên 14 giờ.

3.2.4. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 4

Hình 3.6. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 4 - răng số 1

- Kết quả điện di đã thu được đầy đủ alen ở tất cả các locus gen. Kết quả này cho thấy kiểu gen phân tích được đủ cơ sở để truy nguyên cá thể.

proteinase K và thời gian ủ đã không làm tăng chất lượng ADN thu được. Như vậy, hàm lượng proteinase K bổ sung tối ưu (vừa đảm bảo chất lượng ADN thu được, vừa tiết kiệm hóa chất) là 7 µl, thời gian ủ tối ưu từ 10 - 14 giờ.

- Tiến hành tách chiết như thí nghiệm 3 với 04 mẫu khác có cùng thời gian dưới 02 năm để kiểm tra lại kết quả.

3.2.5. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 5

Hình 3.8. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 5 - răng số 3

- Kết quả điện di đã thu được đầy đủ alen ở tất cả các locus gen, khơng có locus nào bị mất alen, các đỉnh rõ nét, đủ điều kiện để sử dụng cho truy nguyên cá thể.

3.2.6. Đánh giá kết quả tách chiết ADN đối với các mẫu răng và xương có thời gian dưới 02 năm dưới 02 năm

- Qua kết quả của các thí nghiệm kể trên, bằng việc bổ sung thêm 7 µl proteinase K 50 µg/µl (ABI, Mỹ) với hoạt độ 20UI/mg vào quá trình ủ mẫu và tăng

xương, từ đó nâng cao hiệu quả khi sử dụng bộ kit PrepFiler® để tách chiết các mẫu răng xương có thời gian dưới 02 năm.

- Đối với mẫu răng và xương không có sự khác nhau nhiều trong kết quả, như vậy có thể thu bất kì mẫu nào từ hài cốt đều cho hiệu quả như nhau, Khuyến khích thu răng do dễ thu, quá trình làm sạch và nghiền cũng dễ dàng hơn.

- Dự kiến việc tách chiết các mẫu răng xương dưới 02 năm sẽ thu được kết quả trong 02 ngày:

Ngày thứ nhất: Làm sạch mẫu vào buổi sáng, nghiền và ủ mẫu vào buổi chiều. Ngày thứ 2: tách và PCR mẫu vào buổi sáng, điện di và phân tích kết quả vào buổi chiều.

- Dựa vào những kết quả trên, chúng tôi đã tiếp tục áp dụng phương pháp này đối với việc nghiên cứu các mẫu răng và xương có thời gian từ 02 - 10 năm.

3.3. Kết quả tách chiết đối với các mẫu răng và xƣơng có thời gian từ 02 - 10 năm:

3.3.1. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 6

- Kết quả điện di đã thu được alen ở 13 locus nhưng chiều cao các đỉnh có sự chênh lệch rất lớn, chiều cao đỉnh chỉ từ 30 đến 1500 rfu, nhiều đỉnh quá thấp nên kết quả không đủ tin cậy.

- Thí nghiệm đã thu được ADN, chứng tỏ rằng có thể tách được ADN từ răng và xương có thời gian từ 02 - 10 năm. Hàm lượng ADN thấp và chất lượng ADN không tốt, chủ yếu là do chất lượng của răng và xương có thời gian từ 02 - 10 năm đã kém đi rất nhiều so với răng và xương có thời gian dưới 02 năm. Do việc tăng lượng proteinase K đã khơng cịn hiệu quả nên muốn tăng chất lượng ADN cần tăng lượng răng, xương phân tích. Thí nghiệm 7 sẽ được tăng gấp đôi lượng bột răng (xương) thêm vào (100 mg bột răng, xương).

Hình 3.9. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 6 - răng số 4

3.3.2. Phân tích kết quả điện di từ thí nghiệm 7

- Kết quả điện di đã thu được alen ở 13 -14 locus nhưng chiều cao các đỉnh vẫn có sự chênh lệch rất lớn, chiều cao đỉnh chỉ từ 20 đến 2000 rfu, nhiều đỉnh quá thấp nên kết quả không đủ tin cậy. Thậm chí ở mẫu xương cịn có một locus bị mất hẳn.

- Thí nghiệm 7 tuy thu được lượng ADN cao hơn thí nghiệm 6 nhưng khơng đáng kể (hàm lượng ADN trung bình tăng từ 0,444 ng/µl lên 0,485 ng/µl, tăng ~ 10%).

vào quá nhiều nên không thể lắc đều khi ủ mẫu được, dẫn đến hiệu quả của việc ủ mẫu không được như mong muốn, Mặt khác, ở mẫu xương, bước 5, khi rửa mẫu còn có hiện tượng xuất hiện váng màu vàng bám vào hạt từ, khi có hiện tượng đó thì thí nghiệm thu được ADN có chất lượng kém hơn hẳn. Có thể dự đoán hiện tượng này là do ở xương có hàm lượng lipit cao hơn ở răng, khi lấy lượng bột nhiều có thể ức chế hạt từ.

Hình 3.10. Ảnh kết quả điện di của thí nghiệm 7 - răng số 4