CHƢƠNG 2 : THỰC NGHIỆM
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn và mẫu đối chiếu
2.3.1.1 Dung dịch chuẩn gốc THSG 1 mg/ml: cân chính xác 5,0 mg chất chuẩn
THSG, hòa tan trong 5,00 ml EtOH. Các dung dịch chuẩn THSG có nồng độ nhỏ hơn đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc trong EtOH.
2.3.1.2 Dung dịch đối chiếu RV 1 mg/ml: chuẩn bị tƣơng tự dung dịch chuẩn gốc
THSG nhƣng thay dung môi EtOH bằng MeOH.
2.3.1.3 Dung dịch chuẩn gốc EM 1 mg/ml: chuẩn bị tƣơng tự dung dịch chuẩn gốc
THSG nhƣng thay dung môi EtOH bằng MeOH.
2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu
Theo nhƣ tính chất đã biết của các stilben và anthraquinon, tan tốt trong các dung môi hữu cơ nhƣ EtOH, MeOH… Cơng thức cấu tạo của THSG có chứa 1 gốc đƣờng glucose, vì vậy việc sử dụng hỗn hợp dung môi hữu cơ/nƣớc sẽ chiết THSG ra khỏi mẫu thực vật kiệt hơn. Tham khảo các tài liệu [24],[28] và so sánh về độ phân cực của các dung môi, chúng tôi lựa chọn hỗn hợp dung môi chiết là EtOH/H2O bởi EtOH ít gây độc hại, thân thiện với môi trƣờng hơn MeOH.
Đối với các mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ, chúng tôi đã khảo sát và đƣa ra phƣơng pháp xử lý mẫu nhƣ sau:
Phƣơng pháp 1: Cân chính xác khoảng 0,5 g mẫu thử bằng cân phân tích (độ chính xác 0,0001 gam), chuyển mẫu vào bình cầu dung tích 100,0 ml, có nút nhám, thêm 50,0 ml dung mơi EtOH 50% (v/v), thấm ẩm dƣợc liệu trong 10 phút, cân và ghi lại khối lƣợng (m1). Lắp bình cầu vào hệ thống chiết hồi lƣu đã đặt ở nhiệt độ 70oC. Tiến hành chiết hồi lƣu trong 1h. Sau đó để nguội bình cầu về nhiệt độ phịng,
cân bình cầu và bổ sung bằng EtOH 50% đến khối lƣợng ban đầu (m1). Lọc, thu đƣợc dịch chiết mẫu thử (dung dịch A). Lọc dịch chiết này qua màng lọc cellulose axetat 0,45 µm thu đƣợc dung dịch tiến hành sắc ký HPLC (dung dịch B).
Đối với mẫu sản phẩm từ dƣợc liệu hà thủ ô của công ty Traphaco, do trong tá dƣợc có nhiều thành phần đƣờng, vì vậy sau khi chiết để thu đƣợc dung dịch A, mẫu đƣợc loại tạp chất bằng quá trình chiết lỏng – lỏng với dung mơi BuOH trƣớc khi phân tích HPLC. Phƣơng pháp xử lý mẫu đƣợc đƣa ra nhƣ sau:
Phƣơng pháp 2: Lấy khoảng 30 viên thuốc khác nhau, cạo sạch phần bao đƣờng của từng viên, cân khối lƣợng từng viên trên cân phân tích (độ chính xác 0,0001 gam) và xác định khối lƣợng trung bình viên. Nghiền nhỏ viên và trộn đều thu đƣợc mẫu thử. Cân chính xác khoảng 5,0000 g mẫu thử, chuyển mẫu vào bình cầu dung tích 100,0 ml, có nút nhám, thêm 50,0 ml dung môi EtOH 50% (v/v), thấm ẩm dƣợc liệu trong 10 phút, cân và ghi lại khối lƣợng (m1). Lắp bình cầu vào hệ thống chiết hồi lƣu đã đặt ở nhiệt độ 70oC. Tiến hành chiết hồi lƣu trong 1h. Sau đó để nguội bình cầu về nhiệt độ phịng, cân bình cầu và bổ sung bằng EtOH 50% đến khối lƣợng ban đầu (m1). Lọc, thu đƣợc dịch chiết mẫu thử (dung dịch A). Đem toàn bộ dung dịch A cho bay hơi đến cắn trên bếp cách thuỷ, hoà tan cắn trong 10 ml nƣớc cất, chiết với BuOH cho đến khi phân đoạn BuOH nhạt mầu. Gom tất cả dịch BuOH lại, cơ đến cắn trên bếp cách thuỷ, hồ tan cắn trong chính xác 25,0 ml dung mơi EtOH 50% (v/v), lọc qua màng lọc cellulose axetat 0,45 µm thu đƣợc dung dịch tiến hành sắc ký HPLC (dung dịch B).
2.3.3 Phương pháp phân tích
Phép phân tích THSG, RV và EM đƣợc thực hiện trên hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu, kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector UV-VIS.
Detector là một bộ phận có vai trị theo dõi, phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc ký rửa giải ra một cách liên tục, nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích. Trên thực tế, hầu hết các chất nghiên cứu đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV – VIS, vì
vậy detector UV – VIS thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu. Hiện nay mảng diot – photo – array (PDA) phát triển, chúng có vai trị nhƣ một detector UV – VIS nhƣng có khả năng theo dõi chất ở nhiều bƣớc sóng khác nhau ở cùng một thời điểm, và độ nhạy của nó cao hơn detector UV – VIS, tuy nhiên giá thành của detector PDA đắt hơn nhiều so với detector UV-VIS, vì vậy khơng phải đơn vị kiểm nghiệm, sản xuất nào cũng có thể trang bị đƣợc. Dựa vào điều kiện phịng thí nghiệm và nhằm xây dựng một phƣơng pháp có thể ứng dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất, chúng tôi quyết định chọn detector UV – VIS sử dụng chế độ theo dõi chất tại 2 bƣớc sóng để thuận lợi cho việc định lƣợng đồng thời các hợp chất.
Cột tách có vai trị rất quan trọng trong một phép tách sắc ký, nó quyết định hiệu quả tách của quá trình. Để chọn đƣợc một pha tĩnh hay một cột tách phù hợp nhất, ta phải dựa trên những đặc điểm nhƣ: độ phân cực của chất phân tích, chất phân tích đƣợc pha trong mơi trƣờng nhƣ thế nào, có pH ra sao thì mới quyết định chọn pha tĩnh phù hợp. Chất phân tích đƣợc chọn là các hợp chất hữu cơ thuộc nhóm stilben và anthraquinon, đƣợc pha trong MeOH và EtOH. Do các chất phân tích kém phân cực nên phải sử dụng pha tĩnh có bản chất kém phân cực giống nhƣ chất phân tích. Vì vậy, cột pha đảo RP-HPLC là lựa chọn tối ƣu nhất. Trong điều kiện phịng thí nghiệm, chúng tơi đã sử dụng cột tách Ascentis C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) để tách các hợp chất stilben, anthraquinon và định lƣợng chúng.
Các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC đƣợc tóm tắt nhƣ sau: - Nhiệt độ cột: t0phịng (250C – 300C).
- Detector UV-VIS: bƣớc sóng 254 nm và 320 nm. - Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 μl.
- Hệ dung môi gồm 2 kênh. Kênh A: pha nƣớc chứa H3PO4 0,01% (pH ≈ 3,3); Kênh B là ACN.
Bảng 2.2: Chƣơng trình dung mơi rửa giải T
(phút) 0 - 5 5 - 10 10 - 15 15 - 20 20 - 25 25 - 35 35 – 40 45 ACN
(%) 10 - 30 30 30 - 70 70 70 - 100 100 100 - 10 Stop