Mẫu Độ ẩm (%) Khối lƣợng cân (mg) Diện tích pic (S) trung bình (AU.s) Hàm lƣợng THSG (%)* Hàm lƣợng EM (%)* THSG EM Lặp lại TB Lặp lại TB HTO Sơn La 12,17 542,7 1544524 499203 2,23 2,25 ± 0,01 0,070 0,069 ± 0,001 555,0 1623876 500501 2,29 0,069 549,8 1577901 4998921 2,24 0,067 HTO Quảng Ninh 8,48 509,6 2018593 551234 2,95 3,02 ± 0,02 0,079 0,080 ± 0,001 514,9 2112875 565672 3,05 0,080 512,2 2102176 567301 3,06 0,081 HTO Cao Bằng 11,72 650,2 2557014 868542 3,04 3,03 ± 0,01 0,101 0,105 ± 0,005 659,9 2557733 879032 2,99 0,113 670,0 2654091 878365 3,06 0,100 HTO thị trƣờng 10,09 637,7 1872588 < LOD 2,22 2,24 ± 0,02 < LOD <LOD 601,2 1819132 < LOD 2,29 < LOD 650,9 1900300 < LOD 2,21 < LOD HTO Hà Giang 11,56 500,1 2282463 1143993 3,54 3,54 ± 0,02 0,161 0,161 ± 0,001 505,4 2267698 1144402 3,52 0,162 500,9 2290210 1142264 3,56 0,161 HTO Lai Châu 12,43 557,6 1998654 621087 2,84 2,84 ± 0,02 0,070 0,070 ± 0,002 540,4 1890018 604213 2,82 0,069 535,9 1909035 613218 2,85 0,072 HTO Hƣng Yên 12,00 530,3 1860021 439802 2,71 2,74 ± 0,03 0,046 0,045 ± 0,003 531,0 1889803 447120 2,74 0,047 504,9 1776554 399043 2,76 0,041
Kết quả trên cho thấy, hàm lƣợng THSG trong các mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ cao, tƣơng đối ổn định, nằm trong khoảng từ 2,24% đến 3,54% (tính theo khối lƣợng dƣợc liệu khơ tuyệt đối). Trong đó, mẫu hà thủ ơ đỏ thu hái tại Hà Giang có hàm lƣợng THSG cao nhất. Hàm lƣợng EM trong các mẫu hà thủ ô đỏ nằm trong khoảng từ 0,045% đến 0,161% (tính theo khối lƣợng khơ dƣợc liệu tuyệt đối). Trong đó mẫu thu hái tại Hà Giang có hàm lƣợng EM cao nhất và trong các mẫu hà thủ ơ đỏ trên thị trƣờng khơng có mặt thành phần EM.
3.5.2 Mẫu sản phẩm từ hà thủ ô đỏ
Bên cạnh mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ, chúng tôi tiến hành phân tích hàm lƣợng THSG và EM trong các sản phẩm đƣợc chế biến từ hà thủ ô đỏ. Đối tƣợng đƣợc lựa chọn là sản phẩm hà thủ ô của Công ty Cổ phần Dƣợc phẩm TRAPHACO, kí hiệu là T-TPC (Xem hình 2.1). Mẫu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp 2 (mục 2.3.2) và phân tích bằng phƣơng pháp HPLC. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.30 và hình 3.9.
Bảng 3.30: Kết quả phân tích mẫu sản phẩm hà thủ ô của công ty TRAPHACO
Mẫu Khối lƣợng trung bình viên (mg) Khối lƣợng cân (mg) Diện tích pic (S) (AU.s) Hàm lƣợng THSG* (mg/viên) Hàm lƣợng EM* (mg/viên) THSG EM Lặp lại TB Lặp lại TB T- TPC 575,0 4952,5 2665301 < LOD 20,9 20,4 ± 0,5 < LOD < LOD 5000,6 2669122 < LOD 19,9 < LOD 5212,9 2734192 < LOD 20,4 < LOD
A B
Hình 3.9: Sắc ký đồ HPLC phân tích định lƣợng THSG (A) và EM (B) trong mẫu thuốc T-TPC
Nhƣ chúng ta đã biết, giới hạn phát hiện (LOD) của hệ thống HPLC đạt cỡ ppb, mặt khác, giới hạn phát hiện của phƣơng pháp (MDL) phân tích THSG và EM lần lƣợt là 0,32 ppm và 0,43 ppm. Với kết quả trên chứng tỏ trong sản phẩm thuốc kí hiệu T-TPC của Cơng ty cổ phần dƣợc phẩm Traphaco khơng thấy có thành phần EM, hoặc hàm lƣợng EM trong mẫu thấp hơn MDL của phƣơng pháp (< 0,43 ppm). Hàm lƣợng (%) của THSG tính theo khối lƣợng trung bình của một viên thuốc là 20,4 ± 0,5 mg, tức là trong mỗi viên thuốc (có khối lƣợng trung bình là 575,0 mg) thì có khoảng 20,4 mg THSG.
BÀN LUẬN
Với các kết quả đạt đƣợc, chúng tơi có một số bàn luận nhƣ sau:
1. Đã tối ƣu hóa đƣợc các điều kiện phân tích định tính, định lƣợng 3 hoạt chất (THSG, RV, EM) trong dƣợc liệu hà thủ ô đỏ bằng phƣơng pháp HPLC. Trong khi các Dƣợc Điển Việt Nam (I, II, III, IV) đều chƣa quy định và tính đến nay, chƣa có cơng trình cơng bố ở Việt Nam. Vì vậy, nghiên cứu này đƣợc coi là cơng trình đầu tiên nghiên cứu về phƣơng pháp phân tích dƣợc liệu hà thủ ơ đỏ ở Việt Nam.
2. Đã xây dựng đƣợc quy trình định lƣợng đồng thời 2 chất (THSG và EM) trong mẫu dƣợc liệu hà thủ ơ đỏ với tổng thời gian phân tích là 45 phút. Trong khi đó: - DĐTQ có sử dụng định lƣợng đồng thời 2 thành phần nhƣng bằng 2 quy trình
khác nhau. Điều này gây khó khăn, tốn kém cho việc thực hiện.
- DĐHK có đƣa ra một phƣơng pháp định lƣợng 2 thành phần THSG và EM bằng một quy trình nhƣng tổng thời gian phân tích là 70 phút/mẫu.
- Quy trình xây dựng đƣợc đạt đƣợc nhiều ƣu điểm hơn hẳn nhƣ: nhanh hơn, định lƣợng đƣợc đồng thời, dẫn đến tiết kiệm về thời gian và kinh phí.
3. Đã lựa chọn đƣợc phƣơng pháp xử lý mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ phù hợp nhất, đó là: Chiết hồi lƣu 0,5 g mẫu với 50 ml EtOH 50% ở 700
C trong 1h. Trong khi đó:
- DĐTQ sử dụng EtOH 100% làm dung môi chiết. Chúng tôi đã khảo sát và thu đƣợc kết quả là EtOH 50% sẽ chiết đƣợc các chất kiệt hơn EtOH 100%. Vì vậy chúng tơi lựa chọn EtOH 50% làm dung môi chiết.
- DĐHKsử dụng phƣơng pháp chiết siêu âm bằng aceton trong 60 phút. Sau khi khảo sát, chúng tôi đã thu đƣợc kết quả là phƣơng pháp chiết hồi lƣu cho hiệu suất chiết cao hơn hẳn phƣơng pháp chiết siêu âm. Vì vậy, việc sử dụng phƣơng pháp chiết siêu âm trong điều kiện ở Việt Nam là không khả thi. Chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp chiết mẫu là chiết hồi lƣu.
KẾT LUẬN
Với các mục tiêu nghiên cứu đặt ra, chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả nhƣ sau:
1. Đã tối ƣu hóa đƣợc các điều kiện phân tích 03 chất (2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-
2-O-β-D-glucosid, resveratrol và emodin) bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao. Các điều kiện tối ƣu bao gồm:
- Cột tách: Ascentis C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ Supelguard Ascentis C18 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm).
- Detector UV-VIS: bƣớc sóng 320 nm và 254 nm.
- Chọn đƣợc hệ dung môi phù hợp nhất và cho hiệu quả tách tốt nhất 03 hợp chất đã lựa chọn trên hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector UV-VIS. Khảo sát ba hệ là MeOH – nƣớc, ACN – nƣớc và hệ ACN – nƣớc chứa 0,01% axit photphoric (pH ≈ 3,3). Chọn đƣợc hệ ACN – nƣớc chứa 0,01% axit photphoric (pH ≈ 3,3) cho khả năng tách tốt nhất.
- Khảo sát loại axit và tối ƣu đƣợc pH dùng trong pha động (axit phosphoric 0,01%, pH ≈ 3,3).
- Lƣợng mẫu tiêm vào cột phù hợp nhất là 10 μl.
- Khảo sát các chế độ rửa giải gradient khác nhau và chọn ra đƣợc chƣơng trình rửa giải phù hợp nhất.
2. Dựa trên những điều kiện tối ƣu đã khảo sát, đã tiến hành định tính 03 hợp chất (2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, resveratrol và emodin) và định lƣợng đồng thời 02 chất (2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid và emodin).
3. Đã đánh giá đƣợc phƣơng pháp phân tích về: độ lặp lại và tái lặp lại (các
giá trị RSD và RSDR đều nhỏ hơn 1); tính tuyến tính (các giá trị R đều đạt 0,9999); độ đúng, độ thu hồi (hiệu suất thu hồi của THSG và EM đạt trong khoảng 93,5% - 104,7%); giới hạn phát hiện (LOD) của THSG và EM lần lƣợt lầ 0,32 ppm và 0,43 ppm; giới hạn định lƣợng (LOQ) của THSG và EM lần lƣợt là 1,04 ppm và 1,41 ppm.
4. Ứng dụng phƣơng pháp đã xây dựng để phân tích một số mẫu dƣợc liệu hà thủ ô đỏ thu hái tại các vùng khác nhau ở Việt Nam. Kết quả cho thấy hàm lƣợng emodin trong mẫu hà thủ ô đỏ thu hái nằm trong khoảng từ 0,045% đến 0,161%, trong khi mẫu hà thủ ô đỏ trên thị trƣờng khơng phát hiện có emodin. Hàm lƣợng 2,3,5,4′- tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid tƣơng đối ổn định, nằm trong khoảng từ 2,24% đến 3,54%. Kết quả của nghiên cứu này gợi ý cho việc nâng cấp chuyên luận dƣợc liệu hà thủ ô đỏ trong Dƣợc Điển Việt Nam IV.
5. Ứng dụng phƣơng pháp trên để phân tích mẫu sản phẩm thuốc từ hà thủ ô đỏ của công ty cổ phần dƣợc phẩm Traphaco. Kết quả cho thấy ứng với khối lƣợng trung bình của 1 viên thuốc là 575,0 mg, hàm lƣợng 2,3,5,4′- tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid đạt khoảng 20,398 mg/viên và đặc biệt, trong mẫu thuốc này, khơng phát hiện sự có mặt của emodin.
Tài liệu tham khảo Tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, trang 772 – 773.
2. Bộ Y tế (2011), Dược liệu học, tập 1, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, trang 75 – 76.
3. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, II, NXB
KHKT, Hà Nội, trang 884 – 887.
4. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội.
5. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (2003), Các
phương pháp phân tích cơng cụ, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
6. Phạm Thanh Huyền (2013), Nghiên cứu trồng 3 cây thuốc bản địa: Ngũ gia bì gai, Sì to, Hà thủ ô đỏ trong cộng đồng các dân tộc vùng cao ở một số xã
thuộc huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai, Viện Dƣợc liệu, Bộ Y tế.
7. Nguyễn Thị Ngọc Lan (2012), Phân lập một số chất dùng làm chất đối chiếu phục vụ cơng tác tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất lượng dược liệu, Đề tài cấp
cơ sở, Viện Dƣợc liệu, Bộ Y tế.
8. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, trang 833 – 835.
9. Phạm Luận (2000), Giáo trình, Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Đại
Học Khoa Học Tự Nhiên-ĐHQGHN.
10. Nguyễn Văn Ri (2009), Các phương pháp tách, Đại học Khoa học Tự Nhiên – ĐHQGHN.
11. Viện Dƣợc liệu (2008), Chiết xuất dược liệu, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, trang 11-29, 39-49, 66-76.
Tiếng Anh
12. Chen L.L., Huang X.J., Li M.M., Ou G.M., Zhao B.X., Chen M.F. (2012), “Polygonflavanol A, a novel flavonostilbene glycoside from the roots of
Polygonum multiflorum”, Phytochemistry Letters, 5, 756 – 760.
compounds from the Chinese medicinal herb Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc by high-speed counter-current chromatography”, Journal of Chromatography A, 1097, 33–39.
14. Craig Z. and Anna P. (2011), “The photostability and photostabilizationof trans- resveratrol”, Cosmetics & Toiletries magazine, Vol. 126, No. 9.
15. Han D.Q., Zhao J., Xu J., Peng H.S., Chen X.J. and Li S.P. (2013), “Quality evaluation of Polygonum multiflorum in China based on HPLC analysis of
hydrophilic bioactive compounds and chemometrics”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical analysis, 72, 223 – 230.
16. Feng Y. et al (2010), “Emodin, a Natural Product, Selectively Inhibits 11β- Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 and Ameliorates Metabolic Disorder in Diet-Induced Obese Mice", British Journal of Pharmacology, 161 (1), 113– 126.
17. Gu J., Hasuo W., Takeya H, Akasu M. (2005), “Effects of emodin on synaptic transmission in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons in vitro”, Neuropharmacology, 49 (1), 103–111.
18. Hong Kong chinese Materia Medica Standards (2009), volum 3, pp. 223 – 233. 19. Ma J., Qi L.W., Li H.J., Li P. (2012), “A segmental monitoring stragety based
on variable wavelength detection for quality control of three Polygonaceae herbs”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 62, 155 – 161. 20. Koyama J., Takeuchi A., Morita I., Nishino Y., Shimizu M., Inoue M.,
Kobayashi N. (2009), “Characterization of emodin metabolites in Raji cells by LC–APCI-MS/MS”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 17, 7493–7499. 21. Knauer (2011), “Determination of Phthalates”, Applications Journal, page 32. 22. Kim K.W., Ha K.T., Park C.S., Jin U.H., Chang H.W., Lee I.S., Kim C.H.
(2007), “Polygonum cuspidatum, compared with Baicalin and Berbrine, inhibits inducible Nitric Oxide Synthase and Cyclooxygenase-2 Gene Expression in RAW 264.7 macrophages”, Vascular Pharmacology, 47, 99-
23. Liang Z., Chen H., Yu Z., Zhao Z. (2010), “Comparison of raw and processed
Radix Polygoni Multiflori (Heshouwu) by high performance liquid
chromatography and mass spectrometry”, Liang et al. Chinese Medicine, 5
(29).
24. Liang Z., Leung N.N., Chen H. and Zhao Z. (2012), “Quality evaluation of various commercial specifications of Polygoni Multiflori Radix and its dregs by determination of active compounds”, Liang et al. Chemistry Central Journal, 6 (53).
25. Lin S. et al (2011), “Antiproliferative and antimetastatic effects of emodin on human pancreatic cancer”, Oncology Reports, 26 (1), 81–89.
26. Lloyd R. Snyder, Joseph J. Kirkland and John W.Dolan (2010), “Introduction to Modern Liquid Chromatography”, Third Edition A John Wiley & Sons Inc.,
Chap. 4.
27. Michael W.Dong (2006), “Modern HPLC for Practicing Scientists”, A John Wiley & Sons, Inc., Publication, 20 – 25.
28. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (2010), pp. 348 – 349.
29. Sun Y. et al (2008), “Chemosensitization by emodin, a plant-derived anti-cancer agent: mechanism of action”, Cancer Biology & Therapy, 7 (3), 476–478. 30. Xu Y.L., Qi Dong, Hu F.Z. (2009), “Simultaneous quantitative determination of
eight active components in Polygonum multiflorum Thunb. by RP-HPLC”, Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 18, 358 – 361.
31. Yu J., Xie J., Mao X.J., Wei H., Zhao S.L., Ma Y.G., Li N., Zhao R.H. (2012), “Comparison of laxative and antioxidant activities of raw, processed and fermented Polygoni Multiflori Radix”, Chinese Journal of Natural Medicines,
10 (1), 0063-0067.
32. Zhu Z.W., Li J., Gao X.M., Kang L.Y., Hu L.M., Zhang B.L., Chang Y.X. (2012), “Simultaneous determination of stilbenes, phenolic acids, flavonoids and anthraquinones in Radix polygoni multiflori by LC–MS/MS”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 62, 162– 166.
33. Wang M., Zhao R., Wang W., Mao X., Yu J. (2012), “Lipid regulation effects of Polygoni Multiflori Radix, its processed products and its major substances on steatosis human liver cell line L02”, Journal of Ethnopharmacology, 139, 287– 293.