CHƢƠNG 2 : THỰC NGHIỆM
2.4. Nghiên cứu điều kiện tối ƣu và đánh giá phƣơng pháp phân tích
2.4.1 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho q trình phân tích HPLC
Thứ nhất là khảo sát để chọn hệ dung môi pha động, với 3 hệ dung môi là: MeOH-nƣớc, ACN-nƣớc, ACN- nƣớc chứa 0,01% axit photphoric (pH ≈ 3,3).
Sau khi chọn đƣợc hệ dung môi phù hợp chúng tôi đi khảo sát thành phần của pha động, loại axit và nồng độ axit dùng để điều chỉnh pH của pha động (axit fomic, axit axetic và axit photphoric). Giá trị pH pha động cũng đƣợc khảo sát trong khoảng từ 2 đến 5.
Chế độ chạy gradient đã đƣợc khảo sát ở nhiều chƣơng trình khác nhau để chọn đƣợc một chế độ chạy phù hợp nhất, hiệu quả tách tốt nhất. Với tốc độ cố định là 1 ml/phút, tỷ lệ dung môi thay đổi từ 10% ACN đến 95% ACN trong khoảng thời gian 40 phút.
Thể tích mẫu tiêm vào cột cũng đƣợc khảo sát trong khoảng từ 5 μl đến 50 μl.
Các kết quả thu đƣợc ứng với từng khảo sát đƣợc đánh giá, so sánh về thời gian lƣu của các chất định phân tích (tR), về độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS). Phƣơng pháp đánh giá này dựa trên lý thuyết Van Deemter sao cho 1,5 < RS < 2, 0,9 < AS < 1,2, tR của các chất phải không quá lớn nhƣng đảm bảo phải tách xa nhau [27].
2.4.2 Đánh giá phương pháp phân tích
2.4.2.1 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại
Sau khi có đầy đủ các điều kiện tối ƣu, tiến hành dựng các đƣờng chuẩn và thu đƣợc 02 phƣơng trình đƣờng chuẩn. Đánh giá sai số hệ thống của các hệ số trong phƣơng trình hồi quy sử dụng các chuẩn Student và Fisher để đánh giá và kết luận, sau đó mới tiến hành phân tích mẫu thực tế.
Một phƣơng pháp phân đƣợc gọi là tối ƣu trƣớc tiên phải thể hiện độ lặp lại tốt. Trong nghiên cứu chúng tôi đã khảo sát độ lặp lại của hệ thiết bị HPLC sau khi chọn các điều kiện tối ƣu, đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp diện tích và thời gian lƣu của các cấu tử trong dung dịch khảo sát. Dung dịch khảo sát là một mẫu có nồng độ xác định nằm trong giới hạn tuyến tính của đƣờng chuẩn đã xây dựng, đƣợc bơm vào hệ 6 lần sau đó lấy diện tích pic và thời gian lƣu trung bình của các lần và tính đƣợc giá trị % RSD. Giá trị này đánh giá độ lặp cần khảo sát.
Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại và tái lặp lại của quá trình xử lý mẫu cũng đƣợc khảo sát và đánh giá. Để đánh giá độ lặp lại, cùng một mẫu đƣợc cân khối lƣợng gần giống nhau, xử lý cùng một điều kiện. Mỗi mẫu sau xử lý đƣợc bơm 3 lần để thu đƣợc kết quả trung bình. Các giá trị trung bình đó đƣợc sử dụng để đánh giá độ lặp của phƣơng pháp xử lý mẫu. Giá trị % RSD cũng đƣợc dùng làm giá trị đánh giá độ lặp của phƣơng pháp xử lý mẫu. Để đánh giá độ tái lặp lại, 3 kỹ thuật viên (KTV) khác nhau cùng thực hiện phép phân tích trên cùng một mẫu. Các kết quả thu đƣợc dùng làm giá trị đánh giá về độ lệch chuẩn tái lặp tƣơng đối (% RSDR).
2.4.2.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp
Ngồi độ lặp thì độ đúng là một yếu tố để đánh giá phƣơng pháp phân tích. Phƣơng pháp thêm chuẩn đƣợc thực hiện để đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu. Mẫu thực đƣợc thêm một lƣợng nhất định các chất chuẩn vào ở 3 mức nồng độ sao cho tổng hàm lƣợng các chất phân tích sau khi xử lý khơng bị vƣợt quá đƣờng chuẩn. Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn và phân tích trên hệ thống HPLC thu đƣợc hàm lƣợng các chất đƣợc thêm vào và đánh giá độ thu hồi của phƣơng
pháp xử lý mẫu. Sau đó, tiến hành đánh giá, kiểm tra sự sai khác giữa khác giữa giá trị phân tích lại và giá trị thêm chuẩn. Nếu sự sai khác đó khơng có ý nghĩa thống kê, chứng tỏ phƣơng pháp phân tích khơng mắc sai số hệ thống (và ngƣợc lại).
2.4.3 Phân tích mẫu thực tế
Mẫu thử sau khi đƣợc xử lý thu đƣợc dung dịch chạy sắc ký HPLC. Mỗi mẫu đƣợc phân tích lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Hàm lƣợng (%) của EM (THSG) tính theo dƣợc liệu khơ tuyệt đối đƣợc tính theo cơng thức (CT 1):
(CT 1)
Trong đó C là nồng độ EM (THSG) trong dung dịch mẫu thử tính theo phƣơng trình hồi quy (ppm); P là độ tinh khiết của chất chuẩn; V là hệ số pha loãng của dung dịch mẫu thử; m là khối lƣợng mẫu thử đem phân tích (mg); B là độ ẩm mẫu thử (%).