- Malaixia: Là nước mới phát triển nghề chế biến các sản phẩm hàu vì nhu cầu thị trường ngày càng tăng Số lượng bán lên tới 20 triệu đôla một năm Malaixia
1.3.1 Các nghiên cứu protease trong nước và trên thế giới.
Protease là nhóm enzyme xúc tác thuỷ phân liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein, polypeptid và các cơ chất tương tự theo cơ chế sau:
H2N-CH-CO-NH-CH-CO-…-NH-CH-COOH + (n+1) H2O protease
R1 R2 Rn
H2N-CH-COOH + H2N-CH-COOH + … + H2N-CH-COOH
R1 R2 Rn
Trong các protease thì nhóm protease tiêu hoá được nghiên cứu sớm và nhiều hơn cả. Nhưng ngay thế kỷ 18, nhà tự nhiên học Reomur đã phát hiện ra trong dạ dày của chim có tác nhân xúc tác cho quá trình thuỷ phân protein. Sau đó,vào năm 1836, Schwann đã quan sát được hoạt động thuỷ phân protein của tác nhân có trong dịch vị và 30 năm sau người ta tách được enzyme thuỷ phân mà ngày nay gọi là pepsin [3], [21]
20
Năm 1962, Danivevski đã tách được tripsin, amylase tuỵ tạng bằng phương pháp hấp phụ. Nghiên cứu này có ý nghĩa lớn trong tách chiết, nghiên cứu các tính chất của enzyme cũng như protein. Sau đó, hàng loạt enzyme protease đã được nghiên cứu, tách dưới dạng chế phẩm như: papain được Wurtz tách ra năm 1879, bromelain được Crassman, Ambros tách ra năm 1920,… [21]
Năm 1970, Kerry T. Yasunobu và James Mc Conn đã nghiên cứu tách chiết protease trung tính từ môi trường nuôi cấy B.subtilis theo phương pháp nuôi bán rắn và nhận thấy protease này là một protease kim loại có ion Ca2+ trong trung tâm hoạt động, có pHopt = 6,5-7,5, toopt=570C. Protease này bị ức chế bởi Cu2+, Ni2+, Hg2+, Pb2+, Cd2+, Fe2+ và khi có mặt ion Ca2+ enzyme này có thể bền trong khoảng pH = 5.5-10 [3], [21].
Dong Ho Ahn, Hoon Kim và P ack My (1993) đã nghiên cứu về protease trung tính ở A. oryzae và nhận thấy rằng đó là một protease kiềm, trong cấu trúc có 3 cầu disulfid nội phân tử. Enzyme này không bền sau 10 phút xử lý ở 750C, nhưng độ bền của enzyme lại được phục hồi ở trên 750C cho đến 1000C. Đặc tính bền nhiệt này của enzyme là do các liên kết disulfid trong enzyme quyết định.
Để tăng độ bền nhiệt của protease kiềm từ A. oryzae các nhà khoa học Nhật Bản đã tiến hành gây đột biến ở chủng nấm mốc này để tạo ra một liên kết disulfid trong phân tử protease. Kết quả là protease ban đầu của nấm mốc A. oryzae có nhiệt độ tối thích ở 510C nhưng sau khi gây đột biến ở đoạn Cys 169 và Cys 200 thì enzyme này có nhiệt độ tối thích ở 560C [10].
Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu về protease vi sinh vật và nấm mốc đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất và ứng dụng của các nhóm enzyme này trong các lĩnh vực đời sống. Hiện nay, số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới ở các nước phát triển chủ yếu là Châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh thu từ sản xuất enzyme ước tính khoảng 500 triệu USD [8]. Hàng năm trên thế giới có khoảng 600 tấn protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật, trong đó khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Những nước có công nghệ sản xuấ và ứng dụng protease tiên tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo…Các nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng protease từ vi sinh vật. Vi sinh vật chính là đối tượng có thể sản xuất enzyme nói chung và protease nói riêng với số lượng nhiều và giá thành rẻ. Chính vì thế nhịp độ sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào khoảng 5-15%.
21
Ở Việt Nam, có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng protease, các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh chế, nghiên cứu một số đặc tính nghiên cứu của enzyme…Một số công trình nghiên cứu về protease ở Việt Nam như sau:
- Nguyễn Lâm Dũng, Đào Trọng Hùng và Ngô Khắc Truy (1964) đã nghiên cứu sử dụng protease A. oryzae cho thấy có thể sử dụng enzyme này để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm. Sau đó tác giả Nguyễn Lâm Dũng và P hạm Văn Ty (1967) còn tiến hành trộn trực tiếp một số chủng nấm mốc Aspergillus có khả năng sản xuất protease với cá và giữ ở 550C trong khoảng 1-3 ngày, kết quả nghiên cứu cho thấy cá bị thuỷ phân nhanh hơn [3].
- Phạm Thị Trân Châu và các cộng sự (1987) đã nghiên cứu một số tính chất của bromelain tách từ chồi dứa cho thấy trong chồi dứa có 2 protease và bromelain chồi dứa có hoạt tính cực đại ở pH = 6,5; t0opt = 600C. Tới năm 1997, Lê Thị Thanh Mai tiếp tục nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng bromelain đã cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng aceton hay cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton cũng như có thể tinh sạch bromelain bằng phương pháp lọc gel sephadex G-75 với hiệu suất cao [3].
- Ngô Thị Mại, Nguyễn Thị Dự và cộng sự (1991) đã dùng B.subtilis bổ sung vào thuỷ phân cá. Kết quả cho thấy khi bổ sung 0,3% chế phẩm B.subtilis vào chượp, trong điều kiện nhiệt độ 500C thì thời gian chế biến nước mắm rút ngắn còn 10 ngày và 30-35 ngày trong điều kiện tự nhiên mùa hè [3].
- Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự (1993) đã nghiên cứu và cho thấy có thể dùng môi trường nuôi cấy chứa protease của nấm mốc A. oryzae 29A để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm. Tuy nhiên nước mắm sản xuất theo phương pháp này chưa có mùi vị đặc trưng và khâu lọc rút nước mắm còn gặp khó khăn do hỗn hợp chượp đặc nhuyễn [10].
- Tác giả Đặng Văn Hợp (2000) công bố nghiên cứu về protease của A. oryzae A4 cho thấy có thể thu nhận protease từ môi trường nuôi cấy A. oryzae A4
theo phương pháp bề mặt và thu nhận chế phẩm protease kỹ thuật từ canh trường nuôi theo cách chiết rút bằng nước cất rồi kết tủa bằng ammonium sulphate. Enzyme thu được hoạt động tốt nhất ở 500C, pH 6,5 và có thể ứng dụng để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm. [10]
- Vũ ngọc Bội (2004) công bố các nghiên cứu về protease B.subtilis S5 cho thấy có thể dùng nước cất để thu nhận protease với hoạt tính cao từ canh trường
22
nuôi B.subtilis S5 theo phương pháp nuôi cấy bán rắn và thu nhận chế phẩm protease kỹ thuật bằng cách dùng ethanol để gây kết tủa. Protease thu được có nhiệt độ thích hợp là 550C và pH thích hợp là 6,0. Protease này có thể sử dụng rất tốt trong thuỷ phân cơ thịt cá tạp để sản xuất bột đạm thuỷ phân và thuỷ phân cá cơm trong sản xuất nước mắm ngắn ngày [3], [21].
- Đỗ Văn Ninh (2004) công bố các nghiên cứu về protease thu nhận từ nội tạng cá và gan mực cho thấy chế phẩm protease thu được từ nội tạng cá và gan mực là một hỗn hợp gồm nhiều protese có nhiệt độ thích hợp từ 50-550C và hoàn toàn có thể sử dụng protease này trong thuỷ phân cơ thịt cá để sản xuất dịch đạm thuỷ phân ứng dụng trong sản xuất pasta cá cũng như bột dinh dưỡng [18].
Các công trình nghiên cứu trên đã góp phần thúc đẩy lĩnh vực nghiên cứu về protease ở nước ta phát triển. Tuy nhiên, các nghiên cứu ứng dụng protease ở nước ta còn nhiều hạn chế như các chế phẩm enzyme được sản xuất với giá thành còn cao…Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu hạ giá thành chế phẩm enzyme và đưa ra một phương pháp ứng dụng phù hợp với điều kiện sản xuất thực tế tại Việt Nam. Đặc biệt là cần tăng cường nghiên cứu về protease từ vi sinh vật - một lĩnh vực cho phép hạ giá thành chế phẩm enzyme.