CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.4. Phƣơng pháp xác định HCBVTVcơ clo trong đất
2.3.4.1. Hóa chất và thiết bị
- Hóa chất: tồn bộ hóa chất đều thuộc loại tinh khiết dùng cho phân tích sắc ký khí bao gồm: n-hexan, axeton, Na2SO4 khan, phoi đồng, hỗn hợp chất chuẩn (HCH và các đồng phân, DDT và dẫn xuất, aldrin, dieldrin, endrin), Silica gel đƣợc hoạt hóa
ở 670°C trong thời gian 8 giờ và sấy tiếp 2 giờ ở 130°C, đƣợc bảo quản trong chai nút nhám và đặt trong bình hút ẩm trƣớc khi nhồi cột.
- Thiết bị:
+ Hệ thống sắc ký khí khối phổ 7890B/GC 7000C Triple quadrupole MSD của hãng Agilent, Mỹ.
+ Bộ chiết Soxhlet, thiết bị cất quay chân không Kuderna-Danish (K-D), cột silica gel, bếp đun, tủ sấy, bình định mức các loại,…
2.3.4.2. Xử lý sơ bộ và chiết mẫu
- Xử lý sơ bộ: sau khi mẫu đất lấy về đƣợc nhặt sạch sỏi đá, rễ cây, gia công và rây
qua rây 1mm, lấy khoảng 100g phần đất bên dƣới để đem đi phân tích.
- Chiết mẫu: mẫu đƣợc chiết trên hệ soxhlet theo EPA 3540C
- Cân 20g đất trộn với Na2SO4 khan ( tỷ lệ 1:1) cho vào hệ chiết soxhlet.
- Chiết bằng 300ml hỗn hợp dung dịch chiết axeton/n-hexan (1:1,v/v) trong 16 giờ ở chu kỳ 4 vịng/giờ.
- Dung mơi chiết đƣợc đƣa qua 10g Na2SO4 khan, lắc phễu Na2SO4 sao cho loại hết nƣớc ở phần hữu cơ chảy qua phễu.
- Đem bình cầu hứng dung mơi cộng chất bị phân tách sang cất quay chân không ở 40°C , cô mẫu đến khoảng 2ml, Định mức bằng n-hexan đến 10ml và đem làm sạch qua cột silica gel.
2.3.4.3. Làm sạch HCBVTV trên cột silica gel
Cho khoảng 8-10g silica gel vào cốc có chứa 20 ml n-hexan và khuấy đều. Trong cột đã có một ít bơng thủy tinh làm vách ngăn không đƣợc quá dày làm cản trở quá trình rửa, nhƣng khơng đƣợc quá thƣa tránh rơi silica gel, Sau đó chuyển silicagel dạng vữa lên cột, thỉnh thoảng gõ nhẹ vào thành cột để làm chặt cột. Chiều cao lớp silica gel khoảng 10-12 cm. Cho vào cột khoảng 15 cm n-hexan trên cột, vặn van cho chảy nhỏ rồi đƣa từ từ silicagel dạng vữa trong cốc vào cột (vừa đổ vừa
khuấy, luyện cột ngâm khoảng 5 phút khơng để cạn n-hexan tránh khơng khí vào). Khi luyện cột xong, thêm Na2SO4 vào phía trên lớp silica gel (3-4 cm) để
Sau khi nhồi cột xong cho n-hexan chảy cịn trên vạch chất rắn 1cm thì chuyển tồn bộ dịch chiết lên cột. Rửa giải cột với 100 ml n-hexan, tốc độ rửa giải 4-5 ml/phút. Toàn bộ dịch rửa đƣợc cất quay chân không ở 35-40°C, đến 2-5ml. Phần lớn sulfua sẽ bị rửa giải hoàn tồn ở phân đoạn này nên khơng cần bƣớc thử sunfua với phoi đồng.
2.3.4.4. Chuẩn bị dung dịch đường chuẩn và đo mẫu
a. Chuẩn bị dung dịch đƣờng chuẩn
Dung dịch gốc pha thang chuẩn nồng độ 1000 mg/l là hồn hợp chất chuẩn của HCH (α, β, p,p’-DDE; p,p’-DDD; p,p’-DDT; aldrin; dieldrin; endrin. Hút 1 ml dung dịch gốc định mức 100 ml bằng n-hexan đƣợc dung dịch trung gian nồng độ 10 mg/l. Dung dịch làm việc nồng độ 1 mg/l đƣợc hút từ dung dịch trung gian. Từ dung dịch 1 mg/l pha thang chuẩn theo bảng 2.2.
Bảng 2.2. Pha dung dịch đƣờng chuẩn Thang chuẩn Thang chuẩn (µg/l) 0 1 5 10 25 50 Định mức 10ml bằng n-hexan Thể tích hút từ 1mg/l 0 0,01 0,05 0,1 0,25 0,5
b. Đo mẫu trên máy sắc ký khí khối phổ 7890B/GC 7000C Triple quadrupole MSD của Agilent
* Nguyên tắc vận hành
Các cấu tử của mẫu sau khi tách ra khỏi cột mao quản sẽ đi vào trong đầu dò khối phổ. Tại đây diễn ra q trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau nhƣ: kỹ thuật ion hóa va chạm điện tử (EI), ion hóa hóa học (NCI hoặc PCI). Ion sinh ra đƣợc tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đƣa vào bộ phân tích khối. Tại bộ phân tích khối, tứ cực thứ nhất sẽ chọn ion mẹ có m/z xác định, các phân mảnh của ion này đƣợc tạo ra tại buồng va chạm (collision cell) nhờ tƣơng tác với khí trơ (N2) và đƣợc phân tích nhờ tứ cực thứ ba, tạo ra tín hiệu đặc trƣng tại bộ phận phát hiện ion.
Đầu dò khối phổ ba tứ cực 7000C QQQ của Agilent Technologies bao gồm 3 bộ phận chính sau: nguồn ion hóa, bộ phân tích khối và bộ phận phát hiện.
- Nguồn ion hóa: Hoạt động đƣợc với cả hai nguồn ion hóa là va chạm điện tử (EI) và ion hóa hóa học (CI). Model 7000C QQQ có khả năng hoạt động ở hai chế độ ion dƣơng và ion âm trong cùng một lần chạy.
- Bộ phân tích khối: Bộ phân tích khối có nhiệm vụ phân tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. Trong bộ phân tích khối ba tứ cực: trƣớc tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cơ lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu đƣợc các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đƣa vào đầu dò để phát hiện. Với model 7000C QQQ buồng va chạm 6 cực với gia tốc tuyến tính nên có thể vận hành ở tốc độ cao mà không bị hiện tƣợng tạp nhiễm (cross-talk), khí cho buồng va chạm là N2 và làm lạnh với khí He.
- Bộ phận phát hiện: Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion đƣợc đƣa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợc khuếch đại hoặc tạo ra một dịng do điện tích di chuyển.
* Điều kiện phân tích của thiết bị 7890B/GC 7000C Triple quadrupole MSD, Agilent
+ Thông số sắc ký
- Cột: cột mao quản Agilent HP-5 MS UI; 30m * 250 µm (p/n 19091S- 433UI).
- Chƣơng trình nhiệt độ lò: 50°C giữ trong 1,5 phút; tăng 10°C/phút đến 300°C, giữ trong 1 phút.
- Khí mang: Heli
- Tốc độ dòng: 1,1 ml/phút - Nhiệt độ buồng bơm: 280°C - Thể tích bơm mẫu: 1µl
- Chế độ bơm mẫu: Khơng chia dịng (Splitless), rửa sau 1 phút.
+ Thông số khối phổ
- Hệ thống khối phổ: Agilent 7000C MS/MS - Nguồn ion: EI
- Nguồn điện áp: 70 eV - Nhiệt độ nguồn ion: 230°C - Nhiệt độ mặt phân cách: 280°C - Khí va chạm: Nito 1,5 ml/phút - Khí dập tắt: Heli 2,25 ml/phút - Độ trễ dung môi: 2 phút
Bảng 2.3. Thơng số phân tích của các hợp chất cơ clo bằng thiết bị 7890B/GC7000C Triple quadrupole MS Tên chất Thời gian lƣu (phút) Ion mảnh 1 (m/z) Thế CE (V) Ion mảnh 2 (m/z) Thế CE (V) Ion mảnh định lƣợng Ion mẹ α - HCH 15,76 181 - 218 10 181 - 280 10 181 291 β - HCH 17,01 181 - 218 10 181 - 280 10 181 291 CH 17,21 181 - 218 10 181 - 280 10 181 291 HCH 18,52 181 - 218 10 181 - 280 10 181 291 Adrin 22,96 220 - 263 10 220 - 263 10 220 365 Dieldrin 30,05 241 - 279 10 241 - 263 10 241 381 p,p’-DDE 30,35 176 - 246 10 175 - 245 10 176 317 Endrin 31,60 243 - 263 10 82 - 108 10 243 381 p,p’-DDD 33,54 165 - 206 10 165 - 235 10 165 320 p,p’-DDT 36,41 165- 216 10 165- 235 10 165 354
Trong điều kiện nhất định, các hợp chất cơ clo sẽ đi ra khỏi cột trƣớc hay sau phụ thuộc vào ái lực của chất (nhóm chức) đó với cột. Chất nào có ai lực nhỏ sẽ đi ra khỏi cột trƣớc và chất nào có ái lực lớn sẽ đi ra khỏi cột sau. Các chất sẽ lần lƣợt đi ra và cách nhau một khoảng thời gian, không bị chồng chéo lên nhau.
2.3.5. Kiểm sốt chất lượng quy trình phân tích
2.3.5.1. Xác định hiệu suất thu hồi
Xác định độ thu hồi trên mẫu đất đã biết trƣớc hàm lƣợng các HCBVTV cơ clo cần nghiên cứu. Thêm 1ml dung dịch có nồng độ 1 mg/l hỗn hợp các HCBVTV cơ clo (gồm HCH, DDT, aldrin, dieldrin và endrin) vào 20g đất (nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu là 50µg/kg) và làm lặp 3 lần. Tiến hành xác định hàm lƣợng
HCBVTV trên mẫu đất đã thêm chuẩn theo phƣơng pháp EPA 3540C, EPA 3620C, EPA 8270D. Độ thu hồi tính theo cơng thức sau:
% R = . 100 (2.1)
Trong đó: Css: Nồng độ mẫu thêm chuẩn Cts: Nồng độ mẫu thử nghiệm Cs: Nồng độ chất thêm chuẩn vào
2.3.5.2. Xác định độ lặp lại
Thực hiện xác định hàm lƣợng HCBVTV cơ clo (gồm HCH, DDT, aldrin, dieldrin và endrin) trên 1 mẫu thử và lặp lại 7 lần theo phƣơng pháp EPA 3540C, EPA 3620C, EPA 8270D. Độ lặp lại tính theo cơng thức sau:
(2.2)
(2.3) CV (%) = (2.4) Trong đó: Q- giá trị trung bình của n lần thử nghiệm
Qk: giá trị thử nghiệm của lần thứ k n: số lần thử nghiệm lặp lại
S: độ lệch chuẩn lặp lại CV: độ biến thiên (%)
2.3.5.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
Thực hiện 7 lần trên nền mẫu có nồng độ các HCBVTV cơ clo (gồm HCH, DDT, aldrin, dieldrin và endrin) nhỏ và tiến hành xác định hàm lƣợng HCBVTV trên mẫu đất theo phƣơng pháp EPA 3540C, EPA 3620C, EPA 8270D. Giới hạn phát hiện đƣợc tính theo cơng thức sau:
(2.5)
LOD = 3*SD (2.6) LOQ = 10*SD (2.7) Trong đó: xi: giá trị lần thử nghiệm thứ i
: giá trị trung bình của n lần thử nghiệm
LOD: giới hạn phát hiện LOQ: giới hạn định lƣợng SD: độ lệch chuẩn
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Labsolution (Agilent) và Excel để xử lý số liệu
2.3.7. Phương pháp so sánh, đánh giá ảnh hưởng về mặt sinh học
So sánh kết quả nghiên cứu với tiêu chuẩn của US-EPA, 1990 đối với hàm lƣợng HCBVTV cơ clo trong đất: các mức cho phép để không gây ra ảnh hƣởng sinh học đối với động vật đất, sức khỏe con ngƣời (nhiễm độc cấp tính, nhiễm độc mãn tính, tích lũy sinh học) và tiêu chuẩn của Bộ Tài Nguyên và Môi Trƣờng QCVN 54: 2013/BTNMT về ngƣỡng giới hạn cho phép hàm lƣợng HCBVTV trong đất sản xuất nông nghiệp.
2.3.8. Đánh giá rủi ro của HCBVTV cơ clo đối với sức khỏe con người cho vùng nghiên cứu
Nhóm HCBVTV cơ clo tồn lƣu trong đất ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời thông qua tiếp xúc qua da nhƣ làm đất, chăm sóc cây trồng; thơng qua chuỗi thức ăn nhƣ ăn gạo, rau xanh hay hoa quả và bụi từ đất qua đƣờng hô hấp xâm nhập vào cơ thể con ngƣời. Trong phạm vi nghiên cứu của luận văn chỉ xét đến rủi ro ảnh hƣởng sức khỏe con ngƣời thông qua tiếp xúc qua da và tính tốn trên đối tƣợng ngƣời trƣởng thành. Nghiên cứu này sử dụng chỉ số rủi ro ung thƣ Risk theo EPA,1997 đƣợc tính theo cơng thức:
Risk = ADD x SF [24] (2.8)
ADD = [24] (2.9)
∑ Risk = Risk1 + Risk2 + Risk3 +...+ Riskn [24] (2.10) Trong đó: Risk: chỉ số rủi ro ung thƣ
SF: Hệ số dốc đƣờng cong liều lƣợng – phản ứng (kg/ngày/mg) ADI : Liều trung bình tiếp nhận hàng ngày (mg/kg/ngày)
Cs: Nồng độ hóa chất trong đất (mg/kg)
SA: Diện tích bề mặt da tiếp xúc (1815 cm2/ tiếp xúc) * AF: Yếu tố tuân thủ đất-da ( 0,75 mg/cm2)*
ABS: Hệ số hấp phụ qua da của hóa chất trong đất (0,1) [24] EF: Tần số phơi sáng (330 ngày/năm)*
ED: Thời gian phơi nhiễm ( 58 năm)* CF: hệ số chuyển đổi (10-6 kg/mg)* BW: Trọng lƣợng cơ thể ( 60 kg)*
AT: Thời gian trung bình phơi nhiễm ( 25550 ngày)*
Bảng 2.4. Thang đánh giá mức độ rủi ro ung thƣ STT Chỉ số (Risk)* Thang đánh giá STT Chỉ số (Risk)* Thang đánh giá
1 Risk <10-6 Rủi ro ung thƣ thấp, có thể chấp nhận đƣợc
2 10-6< Risk <10-4 Rủi ro ung thƣ trung bình, có thể có hoặc khơng có quyết định giảm thiểm, cần thêm nghiên cứu 3 Risk > 10-4 Rủi ro ung thƣ cao, cần có biện pháp giảm thiểu
Bảng 2.5. Hệ số sử dụng xác định rủi ro ung thƣ STT Tên SF (mg/kg/ngày) STT Tên SF (mg/kg/ngày) 1 Dieldrin 1,3 2 DDE 0,34 3 DDD 0,24 4 α-HCH 6,3 5 β-HCH 1,8 (Nguồn: Guanlin và cs, 2013)
(*) : Lê Thị Hồng Trân (2008), Đánh giá rủi ro sức khỏe và đánh giá rủi ro sinh thái, Nhà
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân tích hàm lƣợng HCBVTV cơ clo tại khu vực nghiên cứu 3.1. Kết quả phân tích hàm lƣợng HCBVTV cơ clo tại khu vực nghiên cứu
3.1.1. Hiệu suất thu hồi
Kết quả thực nghiệm thể hiện trong Bảng 3.1 cho thấy, hiệu suất thu hồi của chất chuẩn nằm trong khoảng từ 94,2 – 103,67%. Hiệu suất này đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn AOAC quy định (từ 80-110%).
Bảng 3.1. Hiệu suất thu hồi của các mẫu thêm chuẩn HCBVTV cơ clo
Tên hợp chất
Mẫu (µg/kg) Mẫu + Chuẩn (µg/kg) Hiệu suất
trung bình (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB α-HCH 30,21 32,81 27,22 30,08 79,56 84,85 80,91 81,78 100,85 β-HCH 36,92 39,11 35,65 37,24 108,91 108,12 106,31 107,78 103,67 -HCH 0 0,01 0,05 0,02 55 54,34 45 51,44 99,37 -HCH 46,88 48,27 45,24 47,76 104,92 95,39 99,61 99,97 102,41 p,p'-DDE 17,42 16,67 18,24 17,78 67,34 69,16 70,19 68,87 100,96 p,p'-DDD 18,36 18,62 18,94 18,64 68,36 69,33 70,46 69,38 100,44 p,p'-DDT 21,29 20,04 20,04 20,46 70,08 70,67 71,37 70,71 99,98 Aldrin 51,19 53,67 51,17 52,02 109,45 114,16 103,06 108,89 94,20 Dieldrin 27,97 23,55 23,60 25,04 73,71 75,96 73,53 74,40 101,36 Endrin 18,53 20,42 20,07 19,67 67,13 68,36 69,21 68,22 96,05
3.1.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là khá thấp và có độ lệch chuẩn (SD) dao động trong khoảng 0,1- 1,34 µg/kg . Độ lệch chuẩn (SD) càng nhỏ thì độ chính xác của phép đo càng cao, kết quả thể hiện trong Bảng 3.2 cho thấy phép đo có độ chính xác cao.
Bảng 3.2. Kết quả xác định LOD, LOQ
Tên chất
Kết quả (µg/kg) SD LOD LOQ
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 Lần 7 TB (µg/kg) α-HCH 26,77 26,22 25,89 26,52 26,38 25,94 26,2 26,27 0,31 0,94 3,1 β-HCH 50,11 50,65 52,01 50,47 50,21 49,84 51,35 50,66 0,77 2,30 7,7 -HCH 37,66 36,5 36,81 38,91 37,15 35,96 38,97 37,36 1,16 3,49 11,6 -HCH 28,15 27,98 28,17 27,97 28,18 27,99 28,13 28,08 0,10 0,29 10 p.p'-DDE 43,67 41,17 41,13 42,26 42,48 42,78 43,01 42,36 0,94 2,81 9,4 p.p'-DDD 23,75 23,6 23,74 24,18 24,14 23,88 23,64 23,85 0,23 0,70 2,3 p.p'-DDT 17,67 18,24 19,6 17,16 17,28 17,73 17,77 17,92 0,82 2,46 8,2 Aldrin 18,42 20,07 20,76 20,54 19,14 21,64 17,92 19,64 1,34 4,02 13,4 Dieldrin 20,39 20,22 20,46 20,24 20,44 20,25 20,35 20,34 0,10 0,30 1,0 Endrin 16,77 16,92 16,71 16,86 17,01 16,83 16,91 16,86 0,10 0,30 1,0
3.1.3. Độ lặp lại
Độ biến thiên (CV) của phƣơng pháp đạt tiêu chuẩn so với AOAC quy định là (<11%) dao động từ 0,72- 8,76 % (Bảng 3.3). Bảng 3.3. Kết quả độ lặp lại Tên chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 Lần 7 TB S CV% µg/kg α-HCH 25,49 26,52 26,88 30,24 32,20 28,14 27,25 28,10 1,59 5,66 β-HCH 52,33 60,47 50,21 59,44 58,95 64,50 58,28 57,74 2,21 3,83 -HCH 331,80 349,91 337,15 340 334,97 335 341,20 338,57 2,43 0,72 -HCH 53,37 51,76 49,28 47,65 50,31 54,17 49,75 50,90 1,52 2,99 p,p'-DDE 19,60 17,16 17,28 17,73 17,77 20,09 17,59 18,17 1,08 5,94 p,p'-DDD 19,94 18,29 18,29 18,54 18,62 20,36 18,52 18,94 0,92 4,85 p,p'-DDT 21,25 20,04 20,04 20,19 20,05 20,57 20,09 20,32 0,67 3,31 Aldrin 50,13 57,26 57,48 62,78 64,01 59,54 61,02 58,89 2,22 3,77 Dieldrin 23,33 24,68 24,42 23,88 23,54 23,64 23,94 23,92 0,69 2,9 endrin 19,76 21,04 17,14 24,64 17,90 16,81 17,34 19,23 1,68 8,76
3.1.4. Hàm lượng một số HCBVTV cơ clo tại xã Phúc Hòa
Đề tài nghiên cứu và xác định một số HCBVTV cơ clo (gồm -HCH; - HCH; -HCH; -HCH; p,p’-DDT; p,p’-DDE; p,p’-DDD; aldrin; dieldrin và endrin). Trong đó, tổng hàm lƣợng DDT tồn lƣu trong đất dao động từ KPH – 0,0932 mg/kg. Tổng hàm lƣợng HCH dao động từ KPH- 0,0426 mg/kg và tổng xyclodien (aldrin, dieldrin, endrin) dao động từ KPH – 0.0088 mg/kg (Bảng 3.4 và Hình 3.1).
0.043 0.0474 0.0743 0.0634 0.1386 0.1374 0 0.05 0.1 0.15 PH1 PH2 PH3 PH4 PH5 PH6