Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Sàng lọc, phân tích cây chuyển gen
- Sàng lọc thông qua phun Basta
Các cây con được trồng trong bầu đất, sau 2 - 3 tuần khi cây đủ ba lá tiến hành phun Basta 2 lần liên tiếp, mỗi lần cách nhau 3 ngày với nồng độ glufosinate 100mg/l. Sau 2 lần phun, quan sát sự biểu hiện của cây, thu mẫu lá các cây con sống sót để tiến hành tách chiết DNA.
- Phân tích cây chuyển gen
· Phương pháp tách chiết DNA tổng số:
DNA được tách chiết và tinh sạch bằng phương pháp CTAB của Saghai Maroof (1984). Hóa chất được sử dụng để tách chiết DNA như sau:
1) Đệm CTAB 100 ml gồm:
- CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) : 2,25 g - β - Mercapto ethanol: 250 µl
- EDTA (Ethylenediamine tetraacetate): 4,5 ml - NaCl 5M: 30 ml - Tris HCl 8,0: 15 ml - H2O: 55 ml 2) Đệm TE EDTA pH 8,0 gồm: - Tris HCl 8,0 : 10 mM - EDTA 8,0 : 1 mM 3) Enzyme Rnase: 10 µg/ml 4) Cồn tuyệt đối lạnh
5) NaCl 5 M
6) Dung dịch (24:1) gồm Chloroform/ Isoamyl alcohol pha theo tỷ lệ 24/1. 7) Dung dịch (25:24:1) gồm Phenol/ Chloroform/ Isoamyl alcohol pha theo tỷ lệ 25/ 24/ 1.
8) Dung dịch rửa là cồn 75%. - Các bước tiến hành :
1. Nghiền 0,3 - 0,5 gam lá đậu tương trong nitơ lỏng thành bột mịn.
2. Chuyển bột lá vào ống ly tâm 1,5 ml. Thêm 0,8 ml đệm CTAB đã ủ ở 65oC trong 10 phút.
3. Ủ các ống ly tâm ở 65oC trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhưng dứt khoát 20 phút một lần để việc tách có hiệu quả.
4. Ly tâm 12.000 vòng/phút, hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung 0,7 ml dung dịch 24:1, lắc nhẹ nhàng trong 10 phút rồi tiến hành ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (lặp lại bước 4 2 lần).
5. Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung (25:24:1) tỷ lệ (1:1) lắc nhẹ trong 20 phút. Rồi tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
6. Hút lớp dịch nổi sang ống mới bổ sung Isopropanol vào tỷ lệ 1:1 với mẫu, bổ sung thêm 3-5 µl NaCl 5M. Lắc nhẹ trong 10 phút. Để trong tủ -200C qua đêm.
7. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa.
8. Rửa với Ethanol 70% sau đó ly tâm 12.000 vịng/phút trong 20 phút (thực hiện 2 lần).
9. Loại bỏ dịch lỏng làm khô bằng máy ly tâm hút chân khơng (5 phút). 10. Bổ sung 30 µl H2O + 1 µl RNAse sau đó ủ ở 37oC trong 30 phút. Đem cất giữ ở - 20oC.
· Phương pháp phân tích PCR
Phân tích PCR được tiến hành với cặp mồi 35S – F/ GmCHS7 – R đặc hiệu cho đoạn cassette biểu hiện gen GmCHS7, trình tự cặp mồi như sau:
35S – F : 5’- GTGACAGATAGCTGGGCAATG-3’ GmCHS7 – R: 5’- TCAGATGGCCACACTATGC – 3’
- H2O 13,1 l - Dung dịch đệm 10x PCR 2,0 l - MgCl (50 mM) 1,0 l - dNTP (10 mM) 2 l - 35S - F (50 ng/l) 0,2 l - GmCHS7 - R (50 ng/l) 0,2 l
- Taq - polymerase (5UI/l) 0,5 l
- DNA (25 ng/l) 1 l
Phản ứng được chạy trên máy PCR với chu trình: 94oC trong 10 phút, (94oC trong 20 giây; 60oC trong 20 giây; 72oC trong 90 giây) x 10 chu kỳ, (94oC trong 20 giây; 52oC trong 20 giây; 72oC trong 90 giây) x 25 chu kỳ, 72oC trong 10 phút, 4oC ở +∞. Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose nồng độ 1%.
· Phương pháp điện di
Điện di được tiến hành trên gel agarose 1%.
· Phương pháp phân tích Southern blot
Phương pháp lai Southern blot được thực hiện theo quy trình của Kit DIG – High Prime DNA Labeling and Detection Starter I , các hóa chất bao gồm:
Bảng 2.1.Hóa chất sử dụng trong phân tích Southern blot
Hóa chất Thành phần
Washing buffer 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; pH 7.5(20° C); 0.3% (v/v) Tween 20
Maleic acid buffer 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; pH 7.5(20° C) Detection buffer 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5 (20° C)
Blocking solution Sử dụng dung dịch 1X bằng cách pha loãng dung dịch 10X Blocking (lọ 6) tỷ lệ trong Maleic acid buffer.
Antibody solution Ly tâm Anti – Digoxigenin – AP (lọ 4) 10.000 vịng/5 phút. Sau đó pha lỗng 5000 lần trong Blocking solution. Colorsubstrate
solution
Quy trình lai được thực hiện như sau:
1. Thực hiện đánh dấu DNA plasmid GmCHS7 với DIG - High Prime
Chúng tôi sử dụng sản phẩm PCR từ DNA plasmid GmCHS7 để tạo probe.
Nồng độ DNA cần để đánh dấu từ 300 ng – 3 µg. Thực hiện phản ứng đánh dấu theo kit của DIG – High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit như sau:
- Cho 16µl sản phẩm PCR plasmid GmCHS7 vào ống eppendorf, biến tính ở 95oC trong vịng 10 phút.
- Làm lạnh nhanh trên đá trong 5 phút rồi đem ly tâm nhanh ở tốc độ 4000 vòng/30 giây để dồn dung dịch xuống đáy ống.
- Thêm 10 µl dung dịch đệm phản ứng reaction buffer vào DNA đã được làm lạnh, đảo trộn nhẹ cho đều, phản ứng nên giữ trên đá.
- Thêm 2 µl chất đánh dấu DIG – High Prime, trộn nhẹ, đều. - Ủ ở 37oC trong vòng 1h cho phản ứng xảy ra
- Probe có thể được dùng ngay, trong trường hợp muốn bảo quản lâu hơn, probe đã đánh dấu được giữ trong 50%V glycerol ở - 15oC đến – 30oC trong 6 tháng (khơng cần xử lý gì thêm dung dịch probe này sau khi bảo quản).
2. Tạo mẫu lai
Sử dùng DNA tổng số đã được tách chiết để thực hiện phản ứng cắt với Enzyme cắt giới hạn BamHI ở thể tích 25µl như sau:
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl Thành phần Thể tích Thành phần Thể tích DNA 8µl (1µg) 10X đệm BamHI 2,5µl Enzyme BamHI 0,5µl Nước 14µl
Tổng cộng 25µl
Tiến hành trộn đều thành phần của các phản ứng cắt theo tổng thể tích đã tính tốn. Sau đó, hỗn hợp đó được phân chia đều thành các phản ứng riêng lẻ ra các ống eppendorf để thực hiện phản ứng cắt. DNA được thêm vào eppendorf chứa hỗn hợp trên, đậy nắp kỹ và đem đi ủ ở 37oC trong khoảng 2 giờ (có thể qua đêm nếu cần thiết).
3. Điện di sản phẩm cắt
- Tiến hành điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5X, với kích thước gel 20 cm x 15 cm x 0,5 cm, gel được gắn lược 20 giếng. Cần có đối chứng dương (30 – 100 pg plasmid dùng để chuyển gen) và đối chứng âm (DNA cây không chuyển gen).
- Rửa sạch khuôn, lược và tank điện di. Chuẩn bị dung môi điện di TAE 0,5X cho vào tank.
- Chuẩn bị gel 1% (w/v). Đun agarose tan dung môi TAE 1X cần dùng bằng lị vi sóng (microwave) và cho 2μl Ethium Bromide (EtBr) (10mg/ml dung dịch stock) vào 100 ml dung dịch gel. Đổ gel dày khoảng 5 – 6 mm.
- Sau khi đổ gel khoảng 30 phút, lấy lược ra đặt gel và khuôn vào trong tank điện di
- Cho 5μl loading dye 6X và trộn với mẫu DNA, sau đó cho mỗi mẫu vào mỗi giếng, sử dụng khoảng 500ng DNA marker có kích thước phù hợp vào giếng đầu hoặc cuối của gel.
- Chạy gel ở 40V trong 15 giờ.
- Ngừng chạy điện di. Kiểm tra gel dưới ánh sang UV. Chụp hình gel lại. Miếng gel đó sẽ được làm biến tính trước khi chuyển lên màng (chú ý miếng gel trước khi chuyển lên màng khơng nên để lâu trong khơng khí vì như thế sẽ làm cho bề mặt miếng gel bị khô và ảnh hưởng không tốt đến quá trình chuyển lên màng. Thời gian giữ gel là 15 - 30 phút khi nó được ngâm trong dung dịch đệm).
Sau khi hoàn thành giai đoạn điện di, gel được giữ trong dung dịch đệm TAE 0,5X. Thực hiện biến tính DNA như sau:
- Đổ bỏ đệm TAE 0,5X, rửa lại miếng gel bằng nước cất và đổ bỏ phần nước rửa.
- Tẩy rửa DNA bằng cách ủ gel trong 250mM HCl trong 10 phút trên máy lắc (tốc độ khoảng 50 – 70 rpm) ở nhiệt độ phòng (màu xanh bromophenol sẽ chuyển sang màu vàng chanh).
- Đổ vào khoảng 300ml dung dịch đệm biến tính (NaOH 0,5M; NaCl 0,15M), phải xem kỹ đảm bảo rằng miếng gel đã được phủ hoàn toàn bởi dung dịch, đem lắc nhẹ 30 phút ở nhiệt độ phịng, đổ bỏ phần dung dịch đó đi.
- Lặp lại bước trên, rửa lại gel bằng nước cất vô trùng, đổ bỏ phần nước rửa. - Đổ vào khoảng 300 ml dung dịch đệm trung tính (Tris – HCl 0,5M; NaCl 0,15M; pH 7,0), miếng gel cũng phải được ngâm hoàn toàn trong dung dịch, đem lắc nhẹ 15 phút ở nhiệt độ phịng, đổ bỏ phần dung dịch đó đi.
- Lặp lại bước trên, trong thời gian này chuẩn bị màng, dung dịch chuyển, giấy thấm, hệ thống mao dẫn và các dụng cụ cần thiết khác.
- Dùng hộp thủy tinh hình chủ nhật (30 cm x 20 cm) có chứa 500 ml SSC 20X, phía trên có đặt một tấm mica (24 cm x 20 cm) làm bệ của hệ thống mao dẫn.
- Cắt một tấm giấy thấm có kích thước phù hợp (30 cm x 15 cm) được làm ướt bằng dung dịch SSC 20X, phủ đều trên tấm mica (tránh có bọt khí, nếu có bọt khí dùng pipet thủy tinh gạt theo một chiều) và hai đầu giấy ngấm vào trong dung dịch đệm để làm cầu mao dẫn.
- Cắt một miếng màng lai Nylon theo kích cỡ của gel. Làm dấu cạnh trên bên trái để nhớ hướng. Khơng được chạm tay khơng có mang găng tay vào màng lai. Bảo vệ màng lai trong q trình thực hiện với nó. Mang găng tay sạch, loại bỏ bụi bẩn bằng cách rửa tay. Cắt 5 miếng giấy Whatman 3MM theo kích thước của gel. Chuẩn bị một xấp giấy thấm (khăn giấy, cắt to hơn kích thước 1cm).
- Nhúng tiếp màng lai Nylon vào SSC 20X, dùng kẹp đầu tròn để thực hiện. Đặt gel lên trên miếng Whatman 3MM sau đó làm ướt bề mặt của gel với 10ml SSC
20X và tránh bọt khí. Chuyển màng lai Nylon lên bề mặt gel và tránh xuất hiện bọt khí (bằng cách từ trung tâm lăn đều ra hai phía). Dùng kẹp mũi trịn để thực hiện ở phần góc của nó.
- Những miếng giấy thấm Whatman cịn lại cũng được làm ướt và đặt trên màng lai, tránh có bọt khí.
- Lăn pipette trên lớp giấy thấm trên và chắc rằng khơng có bọt khí xuất hiện. - Xung quanh gel được đặt bởi những miếng parafilm (có bề ngang khoảng 3-4 cm) trên miếng giấy thấm đầu tiên.
- Phủ trên lớp giấy thắm Whatman bằng một xấp khăn giấy. Tránh tiếp xúc trực tiếp với miếng giấy Whatman 3MM đầu tiên.
- Đặt lên trên là tấm thủy tinh khác và một vật có trọng lượng khoảng 700 - 800 g trên cùng. Đảm bảo sự phân bố áp lực lên là bằng nhau. (Kiểm tra sau 15 phút).
- Thời gian thực hiện khoảng 12 giờ.
5. Cố định DNA trên màng Nylon
- Loại bỏ các giấy thấm một cách cẩn thận. Dùng một giấy thấm Whatman đã được nhúng trong dung dịch SSC 20X đặt trên màng lai.
- Chuyển màng lai lên một giấy thấm khác to hơn (bề mặt có DNA hướng lên trên) và cố định DNA trên màng bằng máy UV crosslinker. Sau đó, màng được đem ra để chuẩn bị lai (hoặc cũng có thể giữ lại trong hộp kín cho đến khi tiến hành lai).
6. Tiền Lai
- Cho màng lai vào trong ống thủy tinh BellCo (mặt khơng có DNA sẽ tiếp xúc với thành của ống BellCo và mặt có DNA sẽ tiếp xúc với dung dịch lai). Cho vào 20ml dung dịch tiền lai (DIG - Easy Hyb). Đặt ống trên vào rotor của máy lai. Quá trình tiền lai khoảng 8 giờ ở nhiệt độ 42oC.
7. Phản ứng lai
- Đun sôi probe trong water bath khoảng 10 phút. Loại bỏ dung dịch tiền lai và cho nhanh 10ml dung dịch lai chứa 20 - 25ng DNA probe/ml đã biến tính DIG - DNA. Chú ý: Trong trường hợp probe mới, đun sôi probe khoảng 5 - 10 phút, đặt
vào trong nước đá khoảng 3 phút và cho trực tiếp vào ống thủy tinh BellCo có chứa sẵn 10ml dung dich DIG - Easy Hyb. Tiến hành lai trong khoảng 12 giờ ở 42o
C (điều kiện tương tự với quá trình tiền lai).
8. Phản ứng hiện màu
Sau khi lai qua đêm, ta tiến hành phản ứng hiện màu, quy trình của DIG – High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit như sau:
- Sau khi lai, rửa màng từ 1 – 5 phút bằng dung dịch Washing buffer. - Ủ màng lai 30 phút trong 100ml dung dịch Blocking solution. - Ủ màng lai 30 phút trong 20ml dung dịch Antibody solution.
- Rửa màng lai 2 lần, mỗi lần 15 phút trong 100ml dung dịch Washing buffer. - Cho 10ml Detection buffer vào màng lai, để khoảng 2 – 5 phút.
- Cho vào màng lai vào hộp kín, tránh ánh sáng, sau đó cho 2ml dung dịch hiện màu Color substrate (các thao tác thực hiện trong buồng tối) và để qua đêm.
- Dừng phản ứng hiện màu bằng cách rửa 5 phút bằng 50ml nước cất khử trùng.