Hình 3.3. Biểu hiện của các cây đậu tương sau khi phun Basta
Tên giống Số mẫu biến nạp (mẫu) Số cây sống sót sau chọn lọc (cây)
Số cây chịu Basta (cây) ĐT22 500 10 4 DT84 500 4 0 DT99 500 7 0 MTĐ176 500 5 0 DT2001 500 5 0
Hình 3.4. Biểu hiện của các cây đậu tương sau khi phun Basta
Kết quả sau 2 lần phun cho thấy, với 10 cây ĐT22, chỉ có 4 cây có biểu hiện chịu với Basta rõ rệt và sống, 6 cây còn lại đều vàng lá và chết khô sau một tuần. Với 4 giống còn lại (DT84, MTĐ176, DT99, DT2001) đều khơng có cây nào sống sót sau 2 lần phun Basta (bảng 3.3). Như vậy không phải tất cả những cây sống sót sau q trình chọn lọc trong nuôi cấy mô đều đã là những cây được chuyển gen. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số kết quả nghiên cứu trước đây [5, 53, 91]. Margie M. Paz, ZhanYuan Zhang & cs (2004) trong thí nghiệm với giống đậu tương William79, sau khi chọn lọc bằng glufosinate ở môi trường nuôi cấy mô, đã nhận được số cây sống là 3, 4, 5, 5 cây (4 lần thí nghiệm). Sau khi trồng ra đất và phun thuốc diệt cỏ Liberty chỉ còn nhận lần lượt là: 0, 2, 2, 2 cây T0 [53]. Trần Thị Cúc Hòa & cs (2008) sau khi tiến hành thí nghiệm với thuốc diệt cỏ Liberty bằng phương pháp bôi thuốc trên lá, với giống mơ hình Maverick, số cây kháng với thuốc diệt cỏ Liberty chỉ đạt 15 cây trên tổng số 35 chồi sống sót sau khi chọn lọc bằng glufosinate; với giống MTĐ176, trong tổng số 36 chồi kháng glufosinate thì chỉ có 9 cây kháng với thuốc diệt cỏ [5].
Về lý thuyết, do gen GmCHS7 và gen bar nằm sát nhau trên cùng một
T – DNA nên rất ít khả năng cây chuyển gen chỉ mang gen bar mà không mang gen
GmCHS7 [3]. Nhiều khả năng, áp lực chọn lọc bằng glufosinate trong cả quá trình
ni cấy mơ giữa các giống là khác nhau, kết quả là một số cây sống sót qua chọn lọc do khả năng kháng thuốc diệt cỏ bẩm sinh cao hơn những cây khác mặc dù không được chuyển gen. Trên thực tế, với áp lực chọn lọc hiện tại, số lượng cây sống sót qua chọn lọc nhưng khơng mang gen khơng q nhiều. Nâng áp lực chọn lọc có thể giảm được số cây dương tính giả nhưng có thể loại bỏ một số cây chuyển gen khơng sống sót được với áp lực chọn lọc cao.
Các cây sống sót sau khi phun Basta đã được tiếp tục chăm sóc và thu lá để tiến hành tách chiết DNA và phân tích PCR.
3.3.2. Kết quả PCR gen GmCHS7
DNA tổng số được điện di kiểm tra độ tinh sạch và chất lượng trên gel agarose 1%. Kết quả ở hình 3.5 cho thấy chất lượng DNA tổng số của các dòng đậu tương đảm bảo chất lượng để tiến hành cho phân tích PCR
Hình 3.5. Kết quả điện di DNA tổng số các cây T0 của giống ĐT22 Ghi chú Ghi chú
1 – 4: DNA tổng số từ mẫu lá của các dịng ĐT22
Để xác định sự có mặt của gen GmCHS7 cùng với promotor 35S trong hệ gen của cây, chúng tơi tiến hành phân tích PCR với mồi xuôi nằm trong vùng promoter 35S - F và mồi ngược nằm trong gen GmCHS7. Như vậy mặc dù mồi
ngược có thể gắn vào gen nội sinh, sản phẩm PCR chỉ được hình thành trên cassette biểu hiện gen mang gen cần chuyển nằm ngay sau promoter 35S.
Qua kết quả PCR và với cặp mồi đặc hiệu 35S – F/GmCHS7 – R cùng với sự biểu hiện của gen bar có thể thấy được gen GmCHS7 và gen chọn lọc bar đã được
chèn vào hệ gen của cây đậu tương ĐT22 (hình 3.6).