đậu tương ĐT22 ở thế hệ T1
Ghi chú
M. Marker (kích thước 1kb) 4. Dòng đậu tương TQB1.1/2 1. Đối chứng (-): Cây ĐT22 không chuyển gen 5. Dòng đậu tươngTQB1.1/3
2. Đối chứng (+): (kích thước 1368 bp) 6. Dòng đậu tương TQB1.1/4 3. Dòng đậu tương TQB1.1/1 7. Dòng đậu tương TQB1.1/7
- Phân tích tiêu chuẩn phù hợp χ2
Để kiểm tra tỷ lệ phân ly của các dòng đậu tương ở thế hệ T1, chúng tơi sử dụng phương pháp phân tích tiêu chuẩn phù hợp χ2. Kết quả thể hiện ở bảng 3.7
Bảng 3.7. Tỷ lệ phân ly của các dòng đậu tương giống ĐT22 ở thế hệ T1
Dòng Tổng số cây Số cây kháng với Basta (cây) Số cây mẫn với Basta (cây) Số cây dƣơng tính với PCR (cây) Tỷ lệ phân ly lý thuyết χ2 TQB1.1 16 13 3 13 3 : 1 0.083 TQB3.2 20 14 6 14 3 : 1 0.068 TQB4.1 11 8 3 8 3 : 1 0.030 TQB7.3 7 3 4 3
Với mức ý nghĩa α = 0,05 và số lớp phân ly m = 2 – 1 = 1 tra bảng giá trị χ2 lý thuyết của phân phối χ2
là 3,84 (Phụ lục bảng 9). Như vậy ở dòng đậu tương TQB1.1 giá trị χ2 thực tế (0,083) nhỏ hơn rất nhiều so với giá trị χ2 lý thuyết (3,84), nên tỷ lệ phân ly của gen GmCHS7 ở dịng TQB1.1 phù hợp sít sao với tỷ lệ 3 : 1 (GmCHS7+
: GmCHS7-) theo định luật Mendel. Tương tự đối với 2 dòng TQB3.2 và TQB4.1, giá trị χ2thực tế (0,068 và 0,030) cũng nhỏ hơn nhiều so với giá trị χ2 lý thuyết (3,84) nên tỷ lệ phân ly 3:1 hồn tồn phù hợp. Cịn đối với dịng TQB7.3 do số cây không đủ lớn (Q < 10) nên phân tích sự phân ly sẽ được thực hiện ở thế hệ T2.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
Từ kết quả nghiên cứu khảo sát, đánh giá khả năng biến nạp gen GmCHS7 vào 5 giống đậu tương Việt Nam thông qua vi khuẩn A. tumefaciens, chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau:
1. Khả năng tạo chồi, tạo đa chồi và tái sinh cây của các giống đậu tương Việt Nam phụ thuộc vào giống. Trong 5 giống đưa vào nghiên cứu, giống đậu tương ĐT22 có khả năng cảm ứng tạo chồi tốt nhất (90,6%), tỷ lệ tạo đa chồi cao nhất (32,5%) và có sức sống mạnh mẽ, có khả năng tái sinh cao.
2. Qua phân tích Southern blot, đã xác định được số bản copy của gen
GmCHS7 ở thế hệ T0 của 4 dòng đậu tương giống ĐT22 (TQB1.1, TQB3.2,
TQB4.1, TQB7.3). 4 dòng này đều mang 1 bản copy của gen chuyển GmCHS7. 3. Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc chặt chẽ vào giống. Trong nghiên cứu của chúng tôi, giống đậu tương ĐT22 là giống đạt hiệu quả chuyển gen GmCHS7 cao
nhất (0,8%). Đây là giống đậu tương tiềm năng, có thể sử dụng để thực hiện chuyển các gen hữu ích khác, phục vụ cho công tác nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương ở Việt Nam.
4. Đã xác định được tỷ lệ phân ly gen GmCHS7 ở thế hệ T1 của 3 dòng
đậu tương thuộc giống ĐT22 (TQB1.1, TQB3.2, TQB4.1) là 3:1 tuân theo định luật Menđen.
5. Đã tạo ra 4 dòng đậu tương ĐT22 chuyển gen GmCHS7 từ thế hệ T0 đến T1, số lượng cây T1 mang gen GmCHS7 của 4 dòng lần lượt là TQB1.1: 13 cây, TQB3.2: 14 cây, TQB4.1: 8 cây, TQB7.3: 3 cây.
2. Đề nghị
1. Tiếp tục đánh giá sự phân ly của gen GmCHS7 ở các thế hệ tiếp theo để
thu được các dòng đồng hợp tử về gen cần chuyển GmCHS7.
2. Tiến hành thí nghiệm với các điều kiện hạn để có thể đánh giá xác thực khả năng chịu hạn, kháng thuốc diệt cỏ và các đặc điểm nơng sinh học của các dịng đậu tương mang gen GmCHS7 thu được.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen động thực vật, NXB ĐH Huế.
2. Trần Văn Điền (2007), Cây đậu tương, NXBNN, Hà Nội.
3. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Lương Thanh Quang, Nguyễn Hữu Kiên, Bùi Thúy Hiền, Dương Tuấn Bảo, Nguyễn Minh Ngọc, Nguyễn Trung Anh, Đỗ Như Quỳnh, Trần Quốc Bảo, Vũ Hoàng Nam, Trần Thu Cúc, Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Nguyễn Văn Đồng (2013), Phân lập và thiết kế
vector phục vụ công tác chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chống chịu với điều kiện bất thuận, Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây
trồng lần thứ nhất.
4. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Tạ Kim Nhung, Trịnh Thị Minh Thùy, Hà Văn Chiến, Lê Thanh Nga, Lê Thị Thu Về, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Lê Huy Hàm (2010), “Kết quả bước đầu trong nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cry1Ac vào phơi non các dịng ngơ mơ hình”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(1), tr. 1-8.
5. Trần Thị Cúc Hòa (2008), “Hiệu quả tạo dòng đậu tương biến đổi gen từ giống MTĐ 176, HL 202, Maverick và William 82 bằng phương pháp nốt lá mầm qua trung gian A. tumefaciens”, Tạp chí Nơng nghiệp và phát triển
nông thôn, 1:71-76.
6. Nguyễn Huy Hoàng (1992), Nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội ở miền Bắc Việt Nam, Luận án phó tiễn sỹ, Hà Nội.
7. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội.
9. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo
các dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội
10. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Thư (2007), “Chuyển gen Gus vào đỉnh phơi hạt chín giống đậu tương ĐT12 thông qua Agrobacterium Tumefaciens”,
Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(4), tr. 471 – 478.
11. Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen ở thực vật, NXB KHKT, Hà Nội
12. Tổng cục Thống kê Việt Nam (2014), “Niên giám thống kê 2014”, Nhà xuất bản thống kê, Hà Nội
13. Đỗ Năng Vịnh (2002), Công nghệ sinh học cây trồng, NXB nông nghiệp,
Hà Nội.
Tiếng Anh
14. Aragão FJL, Sarokin L, Vianna GR, Rech EL. (2000) “Selection of transgenic meristematic cells utilizing a herbicidal molecule results in the recovery of fertile transgenic soybean [Glycine max (L.) Merril] plants at a high frequency”, Theor.
Appl. Genet, 101, pp. 1 – 6.
15. Bravo Angel A.M., Hohn B., Tinland B (1998), “The Omega sequence of Vir D2 is important but not essential for efficient of the T – DNA by Agrobacterium tumefaciens”, Molecular plant Microbe interaction (11), pp. 57 – 63.
16. Chen Shi – Yun (2004), “High – efficiency Agrobacterium – mediated transformantion of soybean”, Acta Botanica simica, 46(5), pp. 610 – 617.
17. Clemente T., LaVallee B.J., Howe A.R., Ward D.C., Rozman R.J., Hunter P.E., Broyles D.L., Kasten D.S., Hinchee M.A. (2000), “Progeny analysis of glyphosate selected transgenic soybeans derived from Agrobacterium-
mediated transformation”, Crop Sci. 40, pp. 797 - 803.
18. Dai, S.H., Zheng, P., Marmey, P., Zhang, S.P., Tian, W.Z., Chen, S.Y., Beachy, R.N., Fauquet, C. (2001), “Comparative analysis of transgenic rice
plants obtained by Agrobacterium – mediated transformation and particle
bombardment”, Mol. Breeding, 7(1), pp. 25 – 33.
19. Dang W, Wei Z (2007), “An optimized Agrobacterium-mediated transformation for soybean for expression of binary insect resistance genes”, Plant Sci., 173, pp. 381 – 389.
20. Dao TT, Linthorst HJ, Verpoorte R (2011), “Chlacone synthase and its functions in plant resistance”, Phytochem Rev., 10(3), pp. 397 - 412.
21. Dhaubhadel S., Gijzen M., Moy P., Farhangkhoee M. (2007), “Transcriptome analysis reveals a critical role of CHS7 and CHS8 genes for isoflavonoid synthesis in soybean seeds”, Plant Physiol, , 143(1), pp. 326 -
338.
22. Di R., Purcell V., Colin G.B., Ghabrial S.A. (1996), “A production of transgenic soybean lines expressing the bean pod mottle virus coat protein precursor gene”, Plant Cell Rep., 7, pp. 399-402.
23. Droste A, Pasquali G, Bodanese-Zanettini MH (2002), “Transgenic fertile plants of soybean (Glycine max (L) Merrill) obtained from bombarded embryogenic tissue”, Euphytica, 127, pp. 367 – 376.
24. Fromm, M., Taylor, L.P., and Walbot, V. (1985), “Expression of gene transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation”. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 82, pp. 5824 - 5828.
25. Finer, J.J (1988), “Apical proliferation of embryogenic suspension culture of soybean (Glycine max Merrill)”, Plant Cell Tissue Organ Cult., 15, pp. 125 - 136.
26. Finer, J.J và McMullen, M.D. (1991), “Transformtion of soybean via particle bombardment of embryogenic suspension culture tissue”. Invitro
Cell Dev.Biol., 27, pp. 175 - 182.
27. Finer JJ, Vain P, Jones MW, McMullen MD (1992), “Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells”, Plant Cell Rep., 11, pp. 323 – 328.
28. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. (1968), “Nutrient requirements of suspension cultures of soybean cells”, Experimental Cell Research 50(1), pp. 151 - 158.
29. Gandhi, A.p (2009), “Review article: Quality of soybean and its products”,
International Food research journal, 16, pp. 11 – 19.
30. Genlvin S.B. (2000), “A. and plant genes involved in T- DNA transfer and intergration”, Rev Plant Physiol Biology, 51, pp. 223 - 256.
31. Gomez KA, Gomez AA (1984), “Statistical procedures for agricultural
research”, Second Ed. John Wiley and Sons Inc., New York – Chichester,
Bribane Toronto Singapore, 680 pages.
32. Guriqbal Signh (2010), “The soybean: Botany, production and uses”, Uk, ISBN – 13, pp. 1 – 47.
33. Gustavo A., Cabrera J. (1998), “The A. tumefaciens: a natural tool for plant transformation”, Plant Cell Report, 26, pp. 1 – 11.
34. Hansen G, Wright MS (1999), “Recent advances in the transformation of plants”, Trends Plant Sci., 4, pp. 226 – 231.
35. Hinchee, M.A.W., D.V.Connor-Ward, C.A.Newell, R.E.McDonnell, S.J.Sato, C.S.Gasser, D.A.Fischhoff, D.B.Re, R.T.Fraley, and R.B.Horsch (1988), “Production of transgenic soybean plants using A.-mediated gene transfer”, Bio/Technol., 6, pp. 915 - 922.
36. Homrich MS, Passaglia LMP, Pereira JF, Bertagnolli PF, Salvadori JR, Nicolau M, Kaltchuk-Santos E, Bodanese-Zanettini MH (2008), “Agronomic performance, chromosomal stability and resistance to velvetbean caterpillar of transgenic soybean expressing cry1Ac gene”, Pesq Agropec Bras., 43, pp. 801 – 807.
37. Hookaas P.J.J., and Beijersbergen, A.G.M (1994), “The virulence system of
A. tumefaciens”. Ann.Rev. Phytopathol., 32, pp. 157 – 179.
38. Hooykaas, P. J. J., & Schilperoort, R. A. (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Molecular Biology, 19(1), pp. 15 - 38.
39. Hu H., Dai M., Yao J., Xiao B., Li X., Zhang Q., Xiong L (2006), “Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice”. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 103, pp. 12 987 – 12 992.
40. Hymowitz T. and Newell C.A. (1981), “Taxonomy of the genus Glycine domestication and uses of soybeans”, Economic Botany, 35, pp. 272 - 288.
41. ISAAA, http://www.isaaa.org/
42. Jame Clive (2014), “Global status of commercialized biotech/GM crops:
2014”, ISAAA Brieft, 49, ISAAA, Ithaca, New York.
43. Jeremy Schmutz , Steven B. Cannon, Jessica S., Jianxin M., Therese M., William N., David L. H., Qijian S., Jay J. T., J., Dong X., Uffe H., Gregory D. M., Yeisoo Y., Tetsuya S., Taishi U., Madan K. B., Devinder S., Babu V., Erika L., Myron P., David G., Shengqiang S., David G., Kerrie B., Montona Futrell G., Brian A., Jianchang D., Zhixi T., Liucun Z., Navdeep G., Trupti J., Marc L., Anand S., Xue C. Z., Kazuo S., Henry T. N., Rod A. W., Perry C., James S., Jane G., Dan R., Gary S., Randy C. S. & Scott A. J., “Genome sequence of the palaeopolyploid soybean”, Nature, 463, pp. 178 – 183.
44. Juan J. Gutierrez - Gonzalez, Satish K. Guttikonda, Lam-Son Phan Tran, Donavan L. Aldrich, Rui Zhong, Oliver Yu, Henry T. Nguyen, David A. Sleper (2010), “Differential Expression of Isoflavone Biosynthetic Genes in Soybean During Water Deficits”, Plant Cell Physiol., 51(6), pp. 936 – 948.
45. Kazuno, N., Kazuko, Y.S (2005), “Molecular studies on stress – responsive gene expression in Arabidopsis and improvement of stress tolerence in crop plants by regular Biotechnology”, JARQ, 39(4), pp. 221 – 229.
46. Kovtun, Y., Chiu, W.L., Tena, G., and Sheen, J. (2000), “Functional analysis of oxidative stress - activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, pp. 2940 – 2945.
47. Lance Gibson and Garren Benson (2005), “Origin, history and uses of
48. Liu Q., Kasuga M., Sakuma Y., Abe H., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K. and Shinozaki K. (1998), “Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/µP DNA binding domain separate two cellular signal transcription pathways in drought- and low-temperatureresponsive gene expression, respectively, in Arabidopsis”, Plant Cell, 10, pp. 1391 - 1406.
49. Liu S.J., Wei Z.M., Huang J.Q. (2008), “The effect of co-cultivation and selection parameters on A.-mediated transformation of Chinese soybean varieties”, Plant Cell Rep., 28, pp. 489 - 498.
50. Lakshmir P.M, Satish K.G (2009), “Physiological and molecular appoches to improve drought resistance in soybean”, Plant Cell Physiol., 50(7), pp. 1260 – 1276.
51. Maitra N., Cushman (1994), “Isolation and characterization of a drought – induced soybean cDNA encoding a D95 family late – embryogenesis – abudant protein”, Plant Physiol, 106(2), pp. 805 - 806
52. Martinell B.J., Julson L.S., Emler C.A., Yong H., Mc Cabe D.E., Williams E.J. (2002), “Soybean Agrobacterium transformation method”, US. Patent Application, No. 6384301.
53. Margie M. Paz, Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K. B. & Wang K. (2004), “Assessment of conditionsaffecting A. - mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica, 136, pp. 167 - 169.
54. Mc Cabe DE, Swain WF (2008), “Stable transformation of soybean callus by DNA-coated gold particles”, Plant Physiol., 87, pp. 671 – 674.
55. Meurer C. A., Drinkins R. D., Colins G.B. (1998), “Factor affecting soybean cotyledonary node transformation”, Plant cell Re., 18, pp. 180 – 186.
56. Mochida K., Yoshida T., Sakurai T., Yamaguchi K., Tran L. S. (2010), “Genome – wide analysis of two component systems and prediction of stress – responsive two component system members in soybean”, DNA Res, 17, pp. 303 – 324.
57. Mochida K., Yoshida T.,Sakurai T. , Yamaguchi K. , Tran L. S. (2009), “In silico analysis of transcription factor repertoire and prediction of stress responsive transcription factors in soybean”, DNA Res., 16(6), pp. 353 – 369.
58. Murashige T. and Skoog F. (1962), “A revised medium for rapid growth and Biosays with tobacco Tissue cultures”, Physiol plant, 15, pp. 473 – 497.
59. Nakashima K, Tran LS., Van Nguyen D., Fujita M., Maruyama K., Todaka
D., Ito Y, Hayashi N, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2007), “Functional analysis of a NAC - type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice”. Plant J, 51, pp. 617–630.
60. Nelson D.E., Repetti P.P., Adams T.R. (2007), “Plant nuclear factor Y (NF-
Y) B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water - limited acres”. Proceedings of the National Academy of Sciences,
USA 104, pp. 16450–16455
61. Nishihama R., Ishikawa M., Araki S., Soyano T., Asada T., Machida Y. (2001), “The NPK1 mitogen-activated protein kinase kinase kinase is a regulator of cell-plate formation in plant cytokinesis”, Genes Dev., 15, pp. 352 – 363.
62. Olhoft P. M., K. Lin ,J. Galbraith, N.C. Nielsen and D.A. Somers (2001), “The role of thiol compounds in increasing A.-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells”, Plant Cell Rep., 20, pp. 731 – 737
63. Olhoft P. M., D.A.Somers (2001), “L - Cysteine increases A.-mediated TDNA delivery into soybean cotyledonary-node cells”, Plant Cell Rep, 20,
pp. 706 – 711.
64. Olhoft, P. M., L.E. Flagel, C. M. Donovan, and D.A. Somers. (2003), “Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method”, Planta, 216, pp. 723 - 735.
65. Owens, L. D., and Cress, D. E. (1985), “Genotypic variability of soybean response to A. strain Ti or Ri plasmids”. Plant Physiol., 77, pp. 87 - 94.
66. Parrott, W.A., Hoffman, L.M., Hildebrand, D.F., Williams and Collin G.B (1989), “Recovery of primary transformation of soybean”. Plant Cell., 2, pp 201 - 204.
67. Paz M.M., Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K. B. & Wang K. (2004), “Assessment of conditionsaffecting A.-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica, 136, pp. 167 - 169.
68. Paz MM, Martinez JC, Kalvig AB, Fonger TM, Wang K, (2006), “Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant
Cell Rep, 25, pp. 206 – 213.
69. Sato H, Yamada T, Kita Y, Ishimoto M, Kitamura K (2007), “Production of transgenic plants and their early seed set in Japanese soybean variety, Kariyutaka”, Plant Biotechnol., 24, pp. 533 – 536.
70. Sato S, Newell C, Kolacz K, Tredo L, Finer J, Hinchee M (1993), “Stable transformation via particle bombardment in two different soybean regeneration systems”, Plant Cell Rep., 12, pp. 408 – 413.
71. Sato S, Xing A, Ye X, Schweiger B, Kinney A, Graef G, Clemente T (2004), “Production of γ-linolenic acid and stearidonic acid in seeds of marker-free transgenic soybean”, Crop Sci., 44, pp. 646 – 652.
72. Shou H., Patricia B., Kan W. (2004), “Expression of the Nicotiana protein kinase (NPK1) enhanced drought tolerance in transgenic maize”, Journal of Experimental Botany, 55(399), pp. 1013 – 1019.