Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Gen liên quan đến khả năng chịu hạn và gen GmCHS7
1.3.1. Khái quát về các gen liên quan đến khả năng chịu hạn
Khả năng chịu hạn ở cây trồng là tính trạng được kiểm sốt bởi nhiều gen. Những cơng trình nghiên cứu về cơ chế phân tử của khả năng chịu hạn của thực vật trong những năm gần đây đã chỉ ra rằng: các gen tham gia vào quá trình chịu hạn của thực vật được chia thành hai nhóm: Nhóm 1 - gen điều khiển (gen tổng hợp protein điều khiển quá trình phiên mã - transcription factor, kinase...) và nhóm 2 - gen chức năng (gen tham gia vào quá trình tổng hợp photphatase, protease, late embryogenesis abundant (LEA), các protein sinh tổng hợp amino acid, đường: proline, mannitol, sorbitol làm cho thực vật tạo ra hàng loạt phản ứng sinh hố và sinh lí để tồn tại và thích nghi [45]. Người ta đã chứng mình được rằng: khi cây gặp điều kiện bất lợi (hạn, mặn…), chỉ cần một gen điều khiển hoạt động sẽ kích hoạt hàng loạt các gen chức năng hoạt động nhằm duy trì sự sống sót của cây trồng. Điều này đồng nghĩa với việc chỉ cần chuyển một gen điều khiển… từ “nguồn cho” sang “cây nhận” thì xác suất bắt gặp “cây nhận” có khả năng chịu hạn, mặn hoặc lạnh là rất cao.
Từ nghiên cứu về khả năng điều khiển tính chịu hạn trong nhóm gen điều khiển
NAC trên Arabidopsis, NAM (no apical meristem), ATAF, CUC (cup - shaped
cotyledon proteins) [78], nhóm nghiên cứu của Hu H. & cs (2006) - Trung tâm Quốc gia về nghiên cứu thực vật Trung Quốc - đã phân lập gen SNAC1 và chuyển vào lúa. Cây lúa chuyển gen tăng cường tính chịu hạn, mặn và qua phân tích microarray thì sự biểu hiện của gen ngoại sinh SNAC1 đã hoạt hoá hàng loạt gen liên quan tính chịu hạn. Kết quả thử nghiệm trên đồng ruộng cho thấy các cây lúa chuyển gen SNAC1 cho năng suất cao hơn 22 - 34% so với các cây đối chứng ở điều kiện hạn [39]. Tương tự nhóm nghiên cứu của giáo sư Shinozaki đã phân lập và nghiên cứu đặc tính của gen OsNAC6 và cho kết quả là các cây lúa chuyển gen tăng cường tính chịu hạn, mặn và lạnh. Đặc biệt, ngồi việc tăng cường tính chống chịu với bất lợi thời tiết, cây lúa chuyển gen
OsNAC6 cịn tăng cường tính kháng hạn bệnh bạc lá so với các cây đối chứng [59].
Protein kinase kích hoạt sự phân bào (Mitogen - actived protein kinase MAPK) đóng vai trị quan trọng trong q trình dẫn truyền tín hiệu ngoại bào và tiến triển của quá trình phát triển tế bào. Nghiên cứu của Nishihama & cs (2001) [61] đã chỉ ra rằng một protein MAP kinase kinase kinase (MAPKKK) điều khiển bởi gen NPK1 có vai trị quan trọng trong q trình phân bào. Một nghiên cứu khác đã chỉ ra biểu hiện của MAPKKK là làm kích hoạt tín hiệu q trình oxy hố trong tế bào từ đó dẫn đến cải thiện khả năng chống chịu với điều kiện lạnh, hạn, mặn ở cây thuốc lá chuyển gen [46]. Shou & cs (2004) [72] đã chuyển đoạn cDNA mã hoá NPK1 (neuropeptide K1) vào cây ngô nhằm nghiên cứu biểu hiện của gen. Kết quả nghiên cứu cho thấy NPK1 tăng cường khả năng chịu hạn ở cây ngô chuyển gen, trong điều kiện hạn, cây ngô chuyển gen cho thấy khả năng quang hợp cao hơn hẳn cây không chuyển gen.
Cũng vào năm 2007, các tác giả Nelson & cs [60] đã công bố giống ngô biến đổi gen mang gen điều khiển tính chịu hạn maize CAAT box transcription factor (ZmNF - YB2) của công ty Monsanto - Mỹ cho năng suất cao gấp hơn hai lần so với đối chứng khi thử nghiệm trên đồng ruộng Châu Phi. Lần đầu tiên, dòng đậu tương biến đổi gen có khả năng kháng hạn rất cao đã được tạo ra khi chúng được biến nạp
gen điều khiển dehydration responsive element biding protein AtDREB2A. Gần đây, trong cơng trình nghiên cứu của Trần & cs (2009) [77] đã chỉ ra rằng ở đậu tương trong số 31 gen điều khiển GmNAC thuộc nhóm gen điều khiển NAC (DNA - binding transcriptional dual regulator of nitrogene assimilation) được kiểm tra, có 9 gen liên quan đến khả năng chịu hạn, mặn và lạnh. Bộ gen của đậu tương đã được giải mã hoàn toàn [43], tạo điều kiện cho nghiên cứu toàn diện gen điều khiển (transcription factors) ở đậu tương. Theo Mochida & cs (2009; 2010) [56, 57] thì ở đậu tương có ít nhất 205 gen điều khiển GmNAC.
1.3.2. Gen GmCHS7
CHS protein (Chalcone synthetase) là enzyme nằm trong chu trình sinh tổng
hợp flavonoid. Nó xúc tác q trình đơng đặc p – coumaroyl - coenzymeA (CoA), là hợp chất được tạo thành từ chu trình phenylpropanoid. Đây là một phần quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp các flavones, isoflavonoid và anthocyanins. Các chất này là thành phần tạo màu sắc chủ yếu trong tự nhiên. CHS protein cũng đóng vai trị trong việc thiết lập hệ thống phòng vệ trước các tác động của môi trường như ảnh hưởng của tia UV - B, chống lại sự lây nhiễm vi sinh vật. Việc hình thành các nốt mầm cũng yêu cầu sự có mặt của CHS protein. Gen mã hóa cho CHS ở đậu tương được đặt tên là Glycine max chalcone synthase (chs) gene - GmCHS [76].
Gen GmCHS7 là một trong 10 gen (GmCHS1 đến GmCHS9 và 1 bản sao của
gen GmCHS1) thuộc họ gen CHS và được phân lập từ đậu tương. Họ gen này mã hóa cho enzyme Chalcone synthase, tham gia sinh tổng hợp Flavonoid/Isoflavonoid [20].
Flavonoid/IsoFlavonoid là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa và một số bộ phận khác của cây (vỏ hạt, vỏ quả…) để thu hút côn trùng đến thụ phấn. Flavonoid/Isoflavonoid được tiết ra bởi rễ các cây chủ để giúp vi khuẩn A. rhizobia trong giai đoạn lây nhiễm của mối quan hệ cộng sinh với các cây họ đậu và đậu tương. A. rhizobia sống trong đất có thể cảm nhận được chất Flavonoid/IsoFlavonoid và tiết ra các chất tiếp nhận. Các chất này lần lượt được các cây chủ nhận biết và có thể dẫn đến sự biến dạng các rễ, cũng như một số phản ứng của tế bào, chẳng hạn như chất khử tạp chất ion và sự hình thành nốt sần ở rễ (root
nodule). Flavonoid/Isoflavonoid (C6 – C3 – C6) cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển, sinh sản và bảo vệ cây trồng chống lại các stress sinh học (nấm, vi khuẩn, virus…) hoặc các stress phi sinh học như hạn hán và nhiệt độ [20].
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng trong họ gen CHS, GmCHS7 là một trong 2 gen đóng vai trị quan trọng nhất trong sinh tổng hợp Flavonoid/Isoflavonoid [21, 41]. Yi. J. & cs (2010) khi nghiên cứu về sự biểu hiện của gen GmCHS7, đã xác
định được gen GmCHS7 có mức độ biểu hiện mạnh nhất ở rễ đậu tương và thấp
nhất ở vỏ quả [88].
1.4. Phƣơng pháp chuyển gen ở đậu tƣơng
Nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương lần đầu tiên được Hinchee & cs, Mc Cable & cs báo cáo vào năm 1988 [35, 54]. Hai phương pháp chính đã được sử dụng và mang lại thành cơng lớn để sản xuất hồn thiện, ổn định các cây chuyển
gen là: Sử dụng súng bắn gen và hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens. Mỗi phương pháp đều có các ưu điểm và nhược điểm khác nhau,
nhưng cả hai hệ thống chuyển gen này đều quan trọng trong khoa học cơ bản và ứng dụng trong nông nghiệp.
1.4.1. Sử dụng súng bắn gen
Kỹ thuật bắn gen dựa trên gia tốc của các hạt bọc DNA về phía tế bào thực vật. Nhờ có gia tốc lớn mà các hạt DNA có thể đâm xuyên qua thành tế bào và màng tế bào. Bên trong tế bào, DNA được phân tách từ các hạt nhỏ và tổng hợp ở trong hệ gen thực vật. Ưu điểm của súng bắn gen là có thể loại bỏ các tác nhân sinh học khơng thích hợp, đặc biệt là với những loại mẫu khơng thích hợp với chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens.
Báo cáo đầu tiên về chuyển gen bằng súng bắn gen vào đậu tương sử dụng chồi phân sinh đỉnh làm mơ đích được McCabe & cs tiến hành năm 1988 [54]. Chồi đỉnh sau khi biến nạp được cảm ứng tạo đa chồi trước khi tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Phân tích khối mơ chuyển gen nhận thấy có các hạt nhỏ mang DNA và có sự tái tổ hợp DNA trong tế bào chủ. Khả năng tổng hợp DNA trong tế bào được xem như biểu hiện của q trình chuyển gen có hiệu quả [54].
* Ưu điểm
- Có thể áp dụng với hầu hết các loại mơ, tế bào, q trình chuyển gen nhanh, đơn giản về mặt kỹ thuật.
- Có thể xử lý một lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn.
- Các vector mang gen tái tổ hợp có cấu tạo đơn giản. Khơng địi hỏi cấu trúc gen kiểu T – DNA như trường hợp chuyển gen bằng Agrobacterium.
- Chỉ cần một lượng nhỏ DNA plasmid.
- Biểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thể quan sát thấy trong vòng vài ngày sau biến nạp.
* Nhược điểm
- Nhiều bản sao của gen biến nạp có thể được chuyển vào tế bào cùng lúc, gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen, dẫn đến biểu hiện của các gen không bền vững, hiệu quả chuyển gen khơng bền vững.
- Địi hỏi thiết bị và vật tư đắt tiền (khơng phải phịng thí nghiệm nào cũng có thể đầu tư).
Mặc dù có nhược điểm, nhưng phương pháp súng bắn gen vẫn được tiếp tục sử dụng. Nhiều tác giả đã thành công bắn gen vào phôi soma và tạo được cây đậu tương biến đổi gen [23, 26, 27].
1.4.2. Chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Đây là phương pháp sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens như một vector sinh
học để biến nạp một phần DNA của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả là tạo được cây biến đổi gen A. tumefaciens xâm nhiễm vào cây trồng thông qua vết thương.
Khi bị tổn thương, mô thực vật sẽ tiết ra hợp chất phenol, hợp chất này sẽ dẫn dụ vi khuẩn Agrobecterium biểu hiện gen vùng vir. Kết quả biểu hiện của gen vir, sợi đơn T - DNA sẽ được chuyển và tổng hợp trong hệ gen thực vật. Vấn đề chính của phương pháp chuyển gen này là sự kết hợp giữ tế bào chủ với vector tương ứng.
Ngược lại với phương pháp súng bắn gen, hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens khơng địi hỏi trang thiết bị đắt tiền, phương pháp kỹ thuật
đơn giản hơn, dễ tiến hành hơn, tạo ra các cây chuyển gen chỉ có 1 hoặc ít bản copy của gen chuyển nên ổn định hơn [18, 34, 75, 79].
Nghiên cứu về chuyển gen đậu tương lần đầu tiên được Hinchee & cs báo cáo vào năm 1988 [35]. Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được tạo ra bằng phương pháp nốt lá mầm sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens làm trung gian. Nốt lá
mầm của giống đậu tương Peking được lây nhiễm với chủng vi khuẩn
A. tumefaciens mang gen chỉ thị gus, gen kháng kanamycin và glyphosate. Mẫu
được ni cấy trên mơi trường có chứa BAP để cảm ứng tạo chồi, kanamycin cùng với các kháng sinh khác có tác dụng loại bỏ lượng vi khuẩn cịn lại sau khi đồng ni cấy. Sau một vài tháng, cây con được tái sinh và được kiểm tra thông qua sự biểu hiện của gen gus hoặc khả năng kháng glyphosate. Chỉ 6% tổng số chồi lựa
chọn được chuyển gen. Tám cây được tái sinh và phân tích, kết quả cho thấy chúng có một sợi DNA chèn vào. Mặc dù sự biến nạp cho hiệu quả không cao nhưng báo cáo chỉ ra rằng có thể tái sinh các tế bào chuyển gen của một giống đậu tương khi được lây nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp [35].
Townsend & Thomas (1993) [83] sử dụng quy trình tương tự đã thu được cây chuyển gen từ giống Pioneer 9341. Các yếu tố quan trọng giúp họ thành cơng đó là (1) sử dụng chất Acetosyringone, (2) giới hạn nhiệt độ giai đoạn đồng nuôi cấy được kiểm soát trong khoảng 18 - 28oC, (3) mật độ tế bào vi khuẩn lây nhiễm từ 108 đến 3 x 109/ml, (4) sử dụng pyroglutamic acid để bổ sung vào trong môi trường tái sinh.
Vi khuẩn A. tumefaciens và nốt lá mầm cũng được sử dụng để chuyển gen tổng hợp protein vỏ của virus Bean Pod Mottle (một loại virus rây bệnh đốm vỏ trên hạt đậu) vào đậu tương [22]. Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển nạp gen thấp, chỉ có 5 cây chuyển gen sơ khởi của 5 lá mầm khác nhau được tạo ra từ 400 lá mầm ban đầu. Phân tích Southern cho thấy sự tích hợp gen BPMVCP - P vào bộ gen và thể hiện qua các cây
R1. Khoảng 30% cây R2 có nguồn gốc từ 1 dịng chuyển gen ban đầu được xét nghiệm ELISA (Enzym - linked Immuno Sorbent Assay) cho thấy khả năng kháng hồn tồn với virus này. Tính trạng hình thái khơng bị biến đổi so với thế hệ R1.
Mặc dù đã thành công trong chuyển gen vào đậu tương thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens nhưng những kết quả ban đầu cho hiệu quả chuyển gen rất thấp. Hơn
hai thập kỷ qua, các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu. Nhiều nỗ lực đã được thực hiện nhằm nâng cao hiệu quả chuyển gen và để tạo ra cây đậu tương biến đổi gen.
Để nâng cao hiệu quả chuyển gen, ngày càng có nhiều nghiên cứu nhằm cải tiến quy trình như bổ sung hợp chất có vai trị xúc tác như Acetosyringone (AS) để kích thích sự biểu hiện tính độc hại của gen vir.
Việc bổ sung các chất L – Cystein và các hợp chất Thiol vào trong môi trường đồng nuôi cấy nốt lá mầm giúp cải thiện hiệu quả chuyển nạp gen qua việc gia tăng số lượng tế bào biến [62, 63], và tạo ra được cây chuyển gen hữu thụ [64]. Sự kết hợp của các chất chống ơxy hóa, sử dụng vector siêu nhị phân và Acetosyringone (AS) cũng làm tăng hiệu suất chuyển gen của các giống đậu tương [19, 49, 69].
Các nghiên cứu sử dụng các chủng vi khuẩn có khả năng gây độc tính cao, xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua nốt lá mầm để tối ưu hóa quy trình, kết hợp lây nhiễm với tái sinh, lựa chọn giống đậu tương và các vector thế hệ mới cũng đã làm tăng hiệu quả chuyển gen vào đậu tương một các đáng kể [53, 55, 64].
Hinchee & cs (1989) lần đầu tiên đã tái sinh thành công cây đậu tương biến đổi gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens bằng cách sử dụng nốt lá mầm làm mơ đích [35]. Sau đó, kỹ thuật chuyển gen đã thu được nhiều thành quả và một số nhóm nghiên cứu có báo cáo rằng các thế hệ cây chuyển gen thu được bằng cách sử dụng các mơ đích khác nhau như nốt lá mầm [49, 63, 64, 67, 68, 90, 91 ], trụ dưới lá mầm (Hypocotyls) [14, 92], phương pháp nửa hạt [68], mô sẹo tạo cơ quan và các lá mầm hợp tử chưa trưởng thành [66, 87].
Một phương pháp mới và có khả năng cho hiệu quả hơn đã được phát triển để biến nạp vi khuẩn A. tumefaciens mang gen vào thẳng tế bào mơ đích. Kỹ thuật
Sử dụng SAAT với nuôi cấy huyền phù phát sinh phơi vơ tính đã cho hiệu quả chuyển gen ổn định và khơng có hiện tưọng thể khảm [74, 82]. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian nuôi cấy cộng sinh mô thực vật với A. tumefaciens được rút
ngắn. Với kỹ thuật hiển vi điện tử quét, nhóm tác giả khám phá ra SAAT, tạo ra những rãnh và khe nhỏ giống nhau, xuyên qua mô, cho phép A. tumefaciens dễ
dàng đi vào mơ đích mong muốn, không giống như phương pháp chuyển nạp gen khác. Sử dụng kỹ thuật SAAT để chuyển gen vào đỉnh sinh trưởng đã làm gia tăng hiệu quả chuyển nạp gen tạm thời trong nhiều cơ quan như: lá, nốt lá mầm, phơi hữu tính, phơi vơ tính, rễ, thân, chồi, hạt qua sự thể hiện gus tăng gấp 100 - 400 lần trên cây Ohio buckeye, đậu đũa (cowpea), cây vân sam trắng (white spruce), lúa mì, ngơ và đậu tương, đồng thời gen chuyển nạp tương đối ổn định qua các thế hệ. Cũng với phương pháp trên C. A. Meurer & cs [55] áp dụng trên 28 giống đậu tương. Nhóm tác giả cho rằng, để thực hiện thành cơng phương pháp SAAT thì cần khảo sát các yếu tố như: chủng vi khuẩn, xác định tế bào chủ và khả năng tiếp nhận gen của mô mong muốn. Với phương phương pháp SAAT, chọn những cụm phơi có 10 - 20 phơi (đường kính 2 – 4 mm) được lây nhiễm với 1 ml dịch khuẩn
A. tumefaciens có nồng độ OD600 = 0,1 - 0,5 trong thời gian 0 - 300 giây. Sau 2
ngày trên môi trường lây nhiễm có 0,1mM Acetosyringone mẫu được chuyển lên