CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.2. Phân lập Vibrio cholerae
Chuẩn bị môi trƣờng chọn lọc (thạch TCBS): 8,8 g thạch TCBS đƣợc pha trong 100 ml cất, sau đó đƣợc đun sơi và đổ 15 ml vào đĩa petri, và để đông 15 phút ở nhiệt độ phòng [29].
Cấy trải phân lập vi khuẩn trên môi trƣờng chọn lọc: 02 mẫu là nƣớc đầm tôm Hải Phịng và nƣớc thốt cống Hà Nội: 10 ml mẫu đƣợc làm giàu 03 lần trong 90 ml môi trƣờng pepton kiềm pH 8,5 ở 37 oC và ni cấy qua đêm. Sau đó, 50 µl dịch nuôi vi khuẩn đƣợc cấy trải đều lên đĩa thạch TCBS và tiếp tục nuôi cấy qua đêm ở 37 oC.
50 µl dịch dịch ni vi khuẩn mua ở Viện 103 (Vibrio cholerae O1) cũng đƣợc cấy trải lên đĩa thạch TCBS và nuôi cấy qua đêm ở 37 oC để làm đối chứng.
Những khuẩn lạc có đặc điểm hình thái giống với khuẩn lạc của Vibrio cholerae trên môi trƣờng TCBS (trịn, có màu vàng, khơng có màng nhầy và khơng
phát quang trong tối) đƣợc lựa chọn để cấy riêng đến khi thuần nhất trên đĩa thạch TCBS và cấy chuyển tiếp trên đĩa thạch pepton kiềm pH 8.5 để bảo quản ở 4 oC.
2.3.3. Xác định trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn
Nuôi cấy và tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc: Từ mỗi đĩa vi khuẩn nuôi cấy, 01 khuẩn lạc mọc riêng rẽ đƣợc lựa chọn và nuôi trong 5 ml dung dịch pepton kiềm pH 8.5, ở 37 oC, 14 - 16 tiếng. Sau đó, dịch ni đƣợc ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút, ở 4 oC trong 10 phút, để thu các tế bào vi khuẩn. Các tế bào này tiếp tục đƣợc dùng để tách chiết DNA tổng số (sử dụng bộ kit của Hãng ANABIO,Việt Nam). Quy trình thực hiện của bộ kit đƣợc nhƣ sau: (1) 100 µl Resuspension buffer đƣợc bổ sung vào tủa tế bào vi khuẩn, trộn đều 10 - 15 giây; (2) 300 µl Binding buffer và 20 µl Proteinase K đƣợc bổ sung vào mẫu, trộn đều 10
- 15 giây và ủ ở 60 oC trong 25 phút; (3) 70 µl Isopropanol đƣợc bổ sung vào mẫu và 700 µl dịch nổi đƣợc chuyển sang ANAPURE filter spin column (cột lọc SC01) đặt trên ANAPURE collection tube (ống thu mẫu CT01); (4) mẫu tiếp tục đƣợc ly lâm ở tốc độ 8000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 1 phút; (5) Dịch trong ống thu mẫu đƣợc loại bỏ và (6) 500 µl Washing buffer 1 đƣợc bổ sung vào cột lọc, ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 1 phút; (7) 500 µl Washing buffer 2 đƣợc bổ sung vào cột lọc và ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút ở nhiệt độ phịng trong 2 phút để loại bỏ hồn toàn đệm rửa dƣ thừa; (8) Cột lọc đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml vơ trùng mới; (9) 50 µl Elution buffer đƣợc bổ sung vào trung tâm của cột lọc và ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 1 phút; (10) Dịch chứa DNA tổng số đƣợc thu lại trong ống eppendorf và bảo quản ở -20 oC.
Phản ứng PCR [7, 29]: Dịch DNA tổng số của mỗi vi khuẩn đƣợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR. Thành phẩn của 1 phản ứng bao gồm: 12,5 µl Master mix 2X, 1 µl mồi 16S Fw 10 µmol, 1 µl mồi 16S Rv 10 µmol, 9,5 µl H2O và 1 µl DNA khn.
Trình tự mồi 16S Fw (27F): 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’ Trình tự mồi 16S Rv (1492R): 5’ GGTTACCTTGTTACGACTT 3’
Chu trình nhiệt: 94 oC, 4 phút để khởi động nóng tiếp nối 30 chu kỳ của ba bƣớc: 94 oC, 30 giây; 54 oC, 45 giây; 72 oC, 1 phút 30 giây, sản phẩm PCR đƣợc ủ ở 72 oC, 7 phút và giữ ở 4 oC (Hình 2.1)
Điện di sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% ở 90 V, 45 phút.
Giải trình tự: Sau khi điện di thu đƣợc băng kích thƣớc khoảng 1,5 kb tƣơng đƣơng với kích thƣớc gen 16S rRNA của V. cholerae, sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và đƣợc xác định trình tự nucleotide bởi First Base Laboratories (Singapore). Các trình tự này đƣợc xử lý bằng phần mềm Clustal W và so sánh với trình tự 16S rRNA của vi khuẩn trên ngân hàng gen bằng phần mềm NCBI blast. Những chủng có trình tự tƣơng đồng > 98% đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo [31].
Hình 2.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
2.3.4. Xác định môi trường dùng để tăng sinh tế bào vi khuẩn V. cholerae
Chuẩn bị môi trƣờng tăng sinh tế bào vi khuẩn: thành phần môi trƣờng bao gồm 200 ml pepton kiềm pH 8.5 (2 g pepton, 2 g NaCl), 200 ml canh thang kiềm pH 8.5 (1g cao thịt, 2 g pepton, 1 g NaCl), 200 ml LB kiềm pH 8.5 (1 g yeast extract, 2 g pepton, 2 g NaCl). Các môi trƣờng đƣợc khử trùng ở 121 oC trong 20 phút.
Nuôi cấy để làm tăng sinh tế bào vi khuẩn (lặp lại đối với 03 chủng vi khuẩn:
V. cholerae chuẩn (ATCC9458), V. cholerae O1 và V. cholerae HP (phân lập từ nƣớc đầm tơm Hải Phịng): Một khuẩn lạc vi khuẩn V. cholerae đƣợc nuôi trong 5 ml môi trƣờng pepton kiềm qua đêm ở 37 oC. 100 µl dịch ni cấy đƣợc cho vào 4,5 ml H2O cất đã khử trùng, đƣợc pha loãng ra các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3,10-4, 10- 5. 500 µl dịch vi khuẩn pha lỗng ở các nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 đƣợc hút và cho vào các lọ chứa 10 ml môi trƣờng chứa một trong 03 loại môi trƣờng (LB kiềm, canh thang kiềm và pepton kiềm) và nuôi cấy ở 37 oC. Sau 4, 6, 8 giờ, 100 µl dịch ni cấy đƣợc lấy ra, pha lỗng, cấy gạt trên đĩa thạch, tiếp tục ni cấy qua đêm ở 37 oC đến khi các khuẩn lạc hình thành rõ rệt. Các khuẩn lạc đƣợc đếm và kết quả đƣợc xử lý thống kê.
2.3.5. Đánh giá phản ứng giữa V. cholerae - kháng thể bằng phương pháp ELISA
100 µl poly L-lysine 0,01% đƣợc hút cho vào các giếng trong đĩa ELISA và đƣợc ủ ở 37 oC trong 1 giờ. Sau đó, các giếng đƣợc rửa bằng 200 µl đệm rửa (PBS 0,01 M; pH 7,4; Tween 20 0,05%), 100 µl vi khuẩn ở nồng độ 108 CFU/ml đƣợc bổ sung và ủ ở 4 oC qua đêm. 200 µl BSA 1% đƣợc bổ sung vào mỗi giếng chứa vi
khuẩn nuôi cấy, ủ ở 37 oC trong 2 giờ. Tƣơng tự, các giếng đƣợc rửa sạch bằng đệm rửa và đƣợc bổ sung lần lƣợt nhƣ sau: 100 µl đệm PBS 0,01 M; pH 7,4; 100 µl kháng thể đơn dịng kháng V. cholerae gây trên chuột_KT1 nồng độ 5 µg/ml và 100 µl kháng thể đơn dịng kháng V. cholerae gây trên chuột _KT2 nồng độ 5 µg/ml, ủ 37 oC trong 1 giờ. Đĩa đƣợc rửa bằng đệm rửa để loại bỏ các kháng thể gắn khơng đặc hiệu. 100 µl kháng thể đa dòng kháng IgG của chuột gắn enzyme peroxidase củ cải ngựa-HRP (KT3), nồng độ 0,2 µg/ml đƣợc bổ sung tiếp tục vào mỗi giếng, hỗn hợp đƣợc ủ ở 37 oC trong 1 giờ, sau đó các kháng thể gắn không đặc hiệu đƣợc rửa bằng đệm rửa. 50 µl cơ chất 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) đƣợc bổ sung vào mỗi giếng và hỗn hợp đƣợc ủ 30 phút ở 37 oC trong tối, HRP thủy phân cơ chất tạo sản phẩm màu xanh. 50 µl H2SO4 1N đƣợc bổ sung để làm ngừng phản ứng, trong môi trƣờng axit, sản phẩm phản ứng chuyển sang màu vàng, cƣờng độ màu phản ánh khả năng bắt cặp của kháng nguyên và kháng thể đƣợc đo ở bƣớc sóng A450.
2.3.6. Phương pháp cố định kháng thể lên màng nitrocellulose
02 loại kháng thể (kháng thể KT3 và KT1 hoặc KT3 và KT2) có nồng độ 0,5 mg/ml đƣợc phun trực tiếp lên màng nitrocellulose thành 2 vạch (kháng thể KT3: vạch kiểm chứng, kháng thể KT1 hoặc KT2: vạch thử nghiệm) bằng thiết bị in phun kháng thể Linomat 5 với nồng độ tƣơng ứng là 0,2 µg/mm và 0,3 µg/mm, tốc độ phun 40 nl/s. Sau đó, màng nitrocellulose đƣợc để khô tự nhiên qua đêm ở nhiệt độ phòng để các kháng thể gắn cố định lên màng. Màng đƣợc ngâm trong dung dịch BSA 1%, 10 phút và đƣợc rửa lại bằng đệm PBS 0,01M; pH 7,4; SDS 0,05%, tiếp tục đƣợc để khơ ở nhiệt độ phịng qua đêm [39]. Màng đƣợc cắt thành các que thử rộng 3 mm và đƣợc gắn thêm màng thấm hút ở trên.
2.3.7. Phương pháp cộng hợp vàng vào kháng thể
Chuẩn bị dung dịch hạt vàng: Dung dịch hạt vàng có kích thƣớc nano đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp Turkevich [49]: 20ml dung dịch HAuCl4 0,1% đƣợc đun sôi kết hợp khuấy từ ở tốc độ 1.200 vịng/phút. Sau đó, 2 ml Natri citrate 1% đƣợc bổ sung vào bình dung dịch tiếp tục đƣợc đun sôi khoảng 5 phút (dừng khi dung dịch chuyển từ màu vàng thành màu đỏ rƣợu vang). Sau đó, dung dịch hạt vàng
đƣợc làm nguội ở nhiệt độ phịng và đƣợc bảo quản trong bình tối ở 4 oC. Các hạt vàng đƣợc kiểm tra kích thƣớc bằng cách soi kính dƣới kính hiển vi điện tử (tại Viện Vệ Sinh dịch tễ) và đo bƣớc sóng hấp thụ tối đa bằng máy đo quang phổ.
Cộng hợp hạt vàng vào kháng thể: Để cộng hợp hạt vàng vào kháng thể, dung dịch hạt vàng đƣợc chuẩn về pH 9 bằng đệm borate 0,1 M. Sau đó, 100 µl kháng thể đơn dòng kháng V. cholerae gây từ chuột nồng độ 100 µg/ml đƣợc bổ sung vào 1,5 ml dung dịch hạt vàng đã đƣợc chuẩn pH, lắc ở tốc độ 650 vòng/phút trong 20 phút. Tiếp đến, hỗn hợp dung dịch hạt vàng và kháng thể đƣợc ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 oC. Dịch nổi đƣợc loại bỏ và thu lại kháng thể đã cộng hợp vàng ở đáy ống và 500 µl đệm phosphate 0,01 M; pH 7,4 tiếp tục đƣợc bổ sung. Kết quả phản ứng cộng hợp hạt vàng vào kháng thể đƣợc kiểm tra bằng cách thử phản ứng đối với vạch kiểm chứng trên que thử.
2.3.8. Xác định nồng độ tối ưu của kháng thể gắn lên màng nitrocellulose
Tại vị trí vạch kiểm chứng (vạch C): Kháng thể KT3 đƣợc cố định lên màng nitrocellulose với các nồng độ khác nhau tƣơng ứng là 0,05 µg/mm; 0,1 µg/mm; 0,2 µg/mm và 0,3 µg/mm. Sau đó, 10 µl kháng thể cộng hợp vàng 20 µg/ml đƣợc nhỏ lên màng và quan sát cƣờng độ vạch màu. Nồng độ kháng thể thấp nhất mà vẫn cho tín hiệu rõ đƣợc lựa chọn làm nồng độ tối ƣu và dùng cho các thử nghiệm tiếp theo để tiết kiệm chi phí.
Tại vị trí vạch thử nghiệm (vạch T): Kháng thể KT1 hoặc KT2 đƣợc cố định lên màng nitrocellulose với các nồng độ khác nhau tƣơng ứng là 0,05 µg/mm; 0,1 µg/mm; 0,2 µg/mm và 0,3 µg/mm. Sau đó, que thử đƣợc nhúng vào 100 µl dung dịch vi khuẩn V. cholerae 108 CFU/ml có chứa 10 µl kháng thể cộng hợp hạt vàng (kháng thể phát hiện) 20 µg/ml. Nếu kháng thể KT1 đƣợc cố định thì sử dụng kháng thể KT2 cộng hợp vàng để kiểm tra và ngƣợc lại. Tƣơng tự, lựa chọn nồng độ kháng thể thấp nhất mà vẫn cho tín hiệu rõ là nồng độ tối ƣu.
2.3.9. Phân tích mẫu bằng que thử
Mỗi mẫu phân tích đƣợc nhiễm chủ động vi khuẩn V. cholerae với liều lƣợng
vào giếng ELISA. Sau đó, kháng thể cộng hợp với hạt vàng đƣợc bổ sung một lƣợng nhất định và cắm que thử vào giếng. Kết quả phân tích đƣợc đánh giá dựa vào việc xuất hiện vạch trên que thử và đƣợc coi là dƣơng tính nếu xuất hiện cả 2 vạch, là âm tính nếu chỉ xuất hiện vạch kiểm chứng và khơng có giá trị nếu chỉ xuất hiện vạch thử nghiệm hoặc khơng có vạch nào xuất hiện [3].
2.3.10. Phương pháp xác định ngưỡng và thời gian phát hiện của que thử
Dịch ni vi khuẩn V. cholerae có nồng độ 108 CFU/ml đƣợc pha loãng về 104 - 107 trong môi trƣờng pepton kiềm pH 8,5 và trong nƣớc sinh hoạt. Sau đó, que thử đƣợc nhúng lần lƣợt vào 100 µl dung dịch có chứa V. cholerae với nồng độ khác nhau, bổ sung thêm 8 µl kháng thể cộng hợp vàng 20 µg/ml.
+ Xác định ngƣỡng phát hiện của que thử: là nồng độ V. cholerae thấp nhất mà que thử có thể phát hiện đƣợc.
+ Xác định thời gian phát hiện của que thử: theo dõi thời gian xuất hiện vạch màu trên que thử trong 1, 2, 5, 7, 10, 12 và 15 phút. Thời gian ngắn nhất mà vạch màu xuất hiện rõ trên que thử đƣợc xác định là thời gian phát hiện của que thử.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại với 03 chủng (V. cholerae chuẩn, V. cholerae O1 và
V. cholerae HP) và mỗi chủng đƣợc lặp lại ít nhất 03 lần [12, 21, 48].
2.3.11. Xác định độ đặc hiệu của que thử
Đánh giá độ đặc hiệu với một số chủng vi khuẩn chuẩn gây bệnh khác nhƣ
Samonella, Shigella, E. coli, Listeria, S. aureus, Klebsiella. Các mẫu vi khuẩn
chuẩn đƣợc cấy trên môi trƣờng dịch tƣơng ứng đến nồng độ 106 – 107 CFU/ml. Que thử đƣợc nhúng vào 100 µl dịch ni mỗi loại vi khuẩn và 8 µl kháng thể cộng hợp vàng 20 µg/ml. Kết quả đƣợc đọc sau 5 phút. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 03 lần. Độ đặc hiệu của que thử đƣợc đánh giá thơng qua tỷ lệ các mẫu âm tính đối với các vi khuẩn khác nhau [48].
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập vi khuẩn V. cholerae 3.1. Phân lập vi khuẩn V. cholerae
3.1.1. Phân lập vi khuẩn V. cholerae từ một số nguồn ô nhiễm
Để phân lập vi khuẩn V. cholerae từ các mẫu nƣớc, chúng tôi đã lấy 10 ml
mẫu nƣớc chứa vi khuẩn, làm giàu 03 lần liên tiếp trong môi trƣờng pepton pH 8,5 nhằm hạn chế sự phát hiện của một số vi khuẩn khác trong môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng có pH kiềm, đồng thời làm tăng mật độ của vi khuẩn V. cholerae trong dịch nuôi cấy. Kết quả cấy trải dịch nuôi vi khuẩn trên mơi trƣờng chọn lọc TCBS (Hình 3.1) cho thấy, cả 3 đĩa thạch đều thu đƣợc khuẩn lạc màu vàng đặc trƣng của vi khuẩn V. cholerae. Trong đó, 01 mẫu là vi khuẩn V. cholerae O1 và 02 mẫu là vi
khuẩn đƣợc phân lập từ mơi trƣờng tự nhiên.
Hình 3.1: Sự phát triển của vi khuẩn V. cholerae trên môi trƣờng thạch TCBS
(A: Mẫu nƣớc đầm tơm Hải Phịng; B: Mẫu nƣớc thốt cống Hà Nội; C: Vi khuẩn V. cholerae O1)
3.1.2. Xác định trình tự gen 16S rARN của chủng vi khuẩn phân lập được
Vì mơi trƣờng TCBS có cũng cho phép một số vi khuẩn khác phát triển nhƣ:
Vibrio parahaemolyticus, Vibrio fischeri, Pseudomonas.... Vì vậy, để khẳng định chắc chắn chủng vi khuẩn đã đƣợc phân lập là V. cholerae, chúng tôi đã tiến hành nhân đoạn gen 16S rRNA bằng phƣơng pháp PCR đối với các khuẩn lạc riêng rẽ trên mỗi đĩa, sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và gửi đi xác định trình tự nucleotide để định danh vi khuẩn. Đồng thời, khuẩn lạc cũng đƣợc cấy chuyển và nuôi lỏng trong môi trƣờng pepton kiềm (Do vi khuẩn này chỉ tồn tại trên TCBS khoảng 1 tuần).
1 M 2 3
tổng số của vi khuẩn đƣợc điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra. Kết quả cho thấy (Hình 3.2), chúng tơi đã tách chiết đƣợc DNA tổng số của 03 chủng vi khuẩn. Các mẫu này tiếp tục đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.
.
Hình 3.2: Kết quả tách chiết DNA tổng số
(M: Marker 1 kb; 1: Vibrio cholerae O1; 2: Vi khuẩn phân lập từ mẫu nƣớc Đầm tơm Hải Phịng; 3: Vi khuẩn phân lập từ mẫu nƣớc thoát Hà Nội)
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc điện di trên gel agarose 1%, thu đƣợc các băng có kích thƣớc khoảng 1,5 kb tƣơng đƣơng với kích thƣớc gen 16S rRNA của vi khuẩn V. cholerae (Hình 3.3). Sau đó, sản phẩm PCR đƣợc làm sạch và gửi đi giải trình tự 16S rRNA. Trình tự thu đƣợc này sẽ đƣợc so sánh với các trình tự 16S rRNA khác trên ngân hàng gen (sử dụng phần mềm Blast của NCBI). Kết quả nhận đƣợc cho thấy rằng, 02 trong 03 mẫu phân lập đƣợc là V. cholerae O1 và vi khuẩn phân lập đƣợc từ nƣớc đầm tơm Hải Phịng có độ tƣơng đồng 99% so với trình tự gen 16S rRNA của V. cholerae trên ngân hàng gen (NR_044853.1). Do vậy, vi khuẩn phân lập đƣợc từ nƣớc đầm tơm Hải Phịng đƣợc đặt tên là V. cholerae HP.