CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Chế tạo que thử phát hiện V cholerae trong nguồn nƣớc sinh hoạt
3.4.5. Đánh giá một số chỉ tiêu kỹ thuật của que thử
3.4.5.1. Đánh giá ngưỡng và thời gian phát hiện của que thử
Sau khi tạo đƣợc 2 loại que thử (bao gồm màng nitrocellulose và màng thấm hút trên): Loại 1 (dùng KT1 làm kháng thể phát hiện và KT2 làm kháng thể bắt giữ) và loại 2 (ngƣợc lại so với que thử loại 1), chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng phát hiện vi khuẩn V. cholerae chuẩn (ATCC 9458) của 2 loại que thử này. Kết quả cho thấy, cả hai loại que thử đều có khả năng phát hiện vi khuẩn V. cholerae, các vạch màu bắt đầu xuất hiện sau 1 phút và trở nên rõ nét sau 5 phút. Tuy nhiên, que thử loại 1 cho phép phát hiện ở ngƣỡng nồng độ 105 CFU/ml (Hình 3.15), trong khi que thử loại 2 chỉ phát hiện đến 106 CFU/ml, thời gian phát hiện từ 2 - 5 phút (Hình 3.16). Kết quả này phù hợp với kết quả tăng sinh tế bào vi khuẩn V. cholerae, sau 6
- 8 giờ nuôi cấy số lƣợng tế bào đạt đƣợc từ 106 -107 CFU/ml.
Vạch C Vạch T
Que thử loại 1 tiếp tục đƣợc thử nghiệm với các chủng V. cholerae O1 và chủng V. cholerae HP trong môi trƣờng pepton kiềm và trong nƣớc sinh hoạt. Kết quả cho thấy, que thử đều cho kết quả dƣơng tính đối với các mẫu chứa vi khuẩn V.
cholerae trên 105 CFU/ml (Bảng 3.1).
Nhƣ vậy, nếu sử dụng trực tiếp que thử để phát hiện vi khuẩn V. cholerae thì chỉ có thể phát hiện đến 105 CFU/ml. Trong khi, với nồng độ vi khuẩn tả trong ruột đạt khoảng 102 - 103 CFU/ ml là đã có thể gây bệnh [2]. Chính vì vậy, bƣớc tiến hành ni cấy tăng sinh tế bào vi khuẩn trong môi trƣờng pepton kiềm là rất quan trọng, làm tăng độ nhạy của que thử, cụ thể que thử có thể phát hiện đƣợc mẫu chứa vi khuẩn V. cholerae có nồng độ từ 3 - 4 CFU/ml sau 6 - 8 giờ.
Hình 3.15: Kết quả đánh giá ngƣỡng phát hiện của que thử loại 1 (dùng KT1 làm kháng
thể phát hiện và KT2 làm kháng thể bắt giữ)
108 107 106 105 0 CFU/ml
Bảng 3.1: Kết quả đánh giá ngƣỡng phát hiện của que thử loại 1
đối với 03 chủng V. cholerae
Môi trƣờng Pepton kiềm Nƣớc sinh hoạt
Nồng độ (CFU/ml) 108 107 106 105 104 107 106 105 104
V. cholerae chuẩn 3/3 3/3 3/3 3/3 1/3 3/3 3/3 3/3 0/3 V. cholerae O1 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3/3 3/3 3/3 0/3 V. cholerae HP 3/3 3/3 3/3 3/3 0/3 3/3 3/3 3/3 0/3
Số que thử dƣơng tính (lặp lại 03 lần)
Kết quả đánh giá ngƣỡng phát hiện của que thử trong nghiên cứu này cũng khá tƣơng đồng với kết quả nghiên của Chakraborty và cộng sự với ngƣỡng phát hiện là 107 CFU/ml, đối với các mẫu có nồng độ < 10 CFU/ml thì cần ni cấy tăng sinh trong môi trƣờng pepton kiềm trong 24 giờ để phát hiện [12]; Amanda Debes và cộng sự đã tạo thành cơng que thử có ngƣỡng phát hiện là 106 CFU/ml đối với chủng V. cholerae O1 và 107 CFU/ml đối với chủng V. cholerae O139 với thời gian phát hiện 5-10 phút. Để đảm bảo một mẫu dƣơng tính cho kết quả đúng thì mẫu đƣợc ủ trong mơi trƣờng pepton kiềm từ 5-8 tiếng để khuếch đại tín hiệu bằng cách tăng nồng độ vi khuẩn trong mẫu [21].
3.4.5.2. Đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật của que thử
Độ đặc hiệu của que thử đƣợc đánh giá qua khả năng có phản ứng chéo với các vi khuẩn khác. Các vi khuẩn đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đánh giá độ đặc hiệu của que thử là một số vi khuẩn gây bệnh nhƣ Salmonella, Shigella, Listeria, Klebsiella, S. aureus và E. coli. Độ đặc hiệu kỹ thuật của que thử là tỷ lệ phần trăm
giữa số que thử âm tính với các vi khuẩn khác trên tổng số que thử thử nghiệm. Kết quả về độ đặc hiệu của que thử phát hiện V. cholerae đƣợc trình bày trên Bảng 3.2 và Hình 3.17.
Bảng 3.2. Độ đặc hiệu của que thử phát hiện V. cholerae Số que thử dƣơng tính
(3 lần lặp lại)
Chủng Salmonella Shigella Listeria Klebsiella S. aureus E. coli
Que thử
V. cholerae 0/3 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3
1 2 3 4 5 6
Hình 3.17. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của que thử phát hiện V. cholerae
(1: Salmonella, 2: Shigella, 3: Listeria, 4: Klebsiella, 5: S. aureus, 6: E. coli)
Kết quả trình bày trên Bảng 3.2 cho thấy với 18 que thử phát hiện V. cholerae về khả năng phản ứng chéo với các vi khuẩn khác (3 que/loại vi khuẩn), có
1 que cho kết quả dƣơng tính với vi khuẩn Klebsiella, 17 que cho kết quả âm tính. Từ đó, có thể xác định độ đặc hiệu kỹ thuật của que thử trong thử nghiệm này là 17/18 = 0,94 tƣơng đƣơng 94%. Trong nghiên cứu của Debes và công sự [21], độ đặc hiệu của que thử phát hiện vi khuẩn V. cholerae cũng đã đƣợc xác định khi sử
dụng trực tiếp với các mẫu phân của bệnh nhân là 60% - 70%. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu này khá thấp cho thấy cần phải có sự cải tiến trong q trình xét nghiệm để hạn chế kết quả dƣơng tính giả. Trên thực tế, có nhiều cơng trình nghiên cứu chế tao que thử bằng phƣơng pháp sắc ký miễn dịch để sử dụng cho các xét nghiệm tƣơng tự có độ đặc hiệu cao, do bản chất của cơ chế hoạt động của que thử là dựa trên
tƣơng tác đặc hiệu sinh học giữa kháng nguyên và kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên. Trong một nghiên cứu đánh giá độ đặc hiệu của 3 bộ xét nghiệm thƣơng mại để phát hiện loài Cryptosporidium ở động vật, kết quả cho thấy phƣơng pháp sắc ký miễn dịch có độ đặc hiệu 100% trong khi 2 phƣơng pháp còn lại là EIA (enzyme immunoassay) và ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) có độ đặc hiệu lần lƣợt là 75.9% và 78.9% [20].
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu chúng tôi rút ra một số kết luận sau đây:
1. Đã phân lập đƣợc 01 chủng vi khuẩn có trình tự gen 16S rRNA tƣơng đồng 99% với trình tự gen của V. cholerae từ mẫu nƣớc đầm tơm ở Hải Phịng.
2. Đã lựa chọn đƣợc mơi trƣờng peton kiềm thích hợp cho việc tăng sinh của vi khuẩn V. cholerae sau 8 giờ nuôi cấy, số lƣợng tế bào vi khuẩn có thể tăng từ 3- 4 CFU/ml lên đến 106 - 107 CFU/ml.
3. Đã bƣớc đầu chế tạo thành công que thử gồm: màng nitrocellulose và màng thấm hút trên, có kích thƣớc 3mm x 5 cm, với vạch kiểm chứng là kháng thể đa dịng kháng IgG của chuột gắn enzyme peroxidase (Ab6789_Abcam) có nồng độ tối ƣu là 0,2 µg/mm và kháng thể tại vạch thử nghiệm là kháng thể đơn dòng kháng V. cholerae gây trên chuột (ABIN1825015) có nồng độ tối ƣu là 0,2 µm/mm. Kháng thể phát hiện dùng cho que thử là kháng thể đơn dòng kháng V.
cholerae (ABIN1825014) đƣợc cộng hợp với hạt nano vàng có kích thƣớc khoảng 20 nm và đƣợc dùng 8 µl 20 µg/ml cho 01 lần thử nghiệm. Ngƣỡng phát hiện của que thử là là 105 CFU/ml trong 2 - 5 phút và độ đặc hiệu là 94%.
HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
1. Đánh giá đầy đủ độ nhạy, độ đặc hiệu, thời gian sử dụng và khả năng ứng dụng vào thực tiễn của que thử.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thị Ngọc Dao (2004), Nghiên cứu chế tạo kit phát hiện nhanh, chính xác các vi sinh vật độc hại gây ơ nhiễm khơng khí và nước, Báo cáo tổng kết đề
tài nhánh Đề tài cấp Nhà nƣớc, mã số KC.04.10.
2. Nguyễn Khánh Linh (2010), “Vi khuẩn Vibrio cholerae và dịch bênh tả”, Tạp
chí Khoa học và Ứng dụng, 13, tr. 44-45.
3. Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Lê Quang Hòa (2015), “Nghiên cứu phát triển hệ thống sắc ký miễn dịch cạnh canh phát hiện các độc tố ruột tụ cầu trong sữa”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công
nghệ, 31(1), tr. 23-31.
4. Hà Thị Quyến, Dƣơng Hồng Quân, Đinh Duy Kháng, Phùng Đắc Cam, (2005),“Nghiên cứu chế tạo bộ kit để phát hiện nhanh vi khuẩn tả (Vibrio
cholerae) trong nƣớc”, Tạp chí Sinh học, 27(4), tr. 57-60.
5. Hà Thị Quyến (2006), Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc định typ vi khuẩn Vibrio cholerae phân lập ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện
Công nghệ sinh học.
6. Trần Linh Thƣớc (2007), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước,
thực phẩm và mỹ phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục Hà Nội.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
7. Amann R. I., Ludwig W., and Schleifer K. H. (1995), “Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation”, Microbiological Reviews, 59(1), pp. 143-169.
8. Baumann P., Furniss A. L. & Lee J. V. (1984), “Genus I. Vibrio”, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1, pp. 518-538.
9. Binsztein N., Costagliola M., Pichel M., Jurquiza V., Ramírez F., Akselman R., Vacchino M., Huq A., Colwell R., Ram F. (2004), “Viable but nonculturable
Vibrio cholerae O1 in the aquatic environment of Argentina”, Applied and Environmental Microbiology, 70(12), pp. 7481-7486.
10. Brayton P.R, Roszak D., Palmer L., Huq S., Grimes D., Colwell R. (1986), “Fluorescent antibody enumeration of V. cholerae in the marine environment”,
Microbiology, 3, pp. 507-514.
11. CDC (1999), “for Disease Control and Prevention”, Centers of for Disease Control and Prevention, pp. 136
12. Chakraborty S., Alam M., Scobie H. M., Sack D. A. (2013),“Adaptation of a simple dipstick test detection of Vibrio cholerae O1 and O139 in environmental water”, Frontiers in Microbiology, 4(320), pp. 1-3.
13. Chakraborty S., Mukhopadhyay A. K., Bhadra R., Ghosh A., Mitra R., Shimada T., Yamasaki S., Faruque S., Takeda Y., Colwell R. (2000), “Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholerae”, Applied and Environmental Microbiology, 66(9), pp. 4022-4028.
14. Ching K. H., He X., Stanker L. H., Lin A.V., McGarvey J.A. and Hnasko R. (2015), “Detection of shiga toxins by lateral flow assay”, Toxins, 7, 1163-1173. 15. Choopun N., Louis V., Huq A., Colwell R. (2002), “Simple procedure for rapid identification of Vibrio cholerae from the aquatic environment”, Applied
and Environmental Microbiology , 68(2), pp. 995–998.
16. Chowdhury M. A. R., Hasan J. A. K., Huq A., Xu B., Montilla R. (1994), “DVC-DFA: A simplified technique for detection of viable Vibrio cholerae O1 and O139”, Canadian Journal of Microbiology, 42, pp. 87–93.
17. Chun J., Huq A., Colwell R. (1999), “Analysis of 16S-23S rRNA intergenic spacer regions of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus”, Applied and Environmental Microbiology, 65, pp. 2202–2208.
18. Colwell R., Tamplin M., Brayton P., Gauzens A., Tall B., Herrington D., Levine M., Hall S., Huq A., Sack D. (1990), “Environmental aspects of V. cbolerae in transmission of cholera”, Advances in Research on Cbolera and Related Areas, pp. 327-343.
19. Dallas W., Falkow S. (1980), “Amino acid sequence homology between cholera toxin and Escherichia coli heatlabile toxin”, Nature, 288(5790), pp.
499–501.
20. Danisová O., Halánová M., Valencáková A., Luptáková L. (2017), “Sensitivity, specificity and comparison of three commercially available immunological tests in the diagnosis of Cryptosporidium species in animals”, Brazilian Journal of Microbiology, pii: S1517-8382(16)30986-8.
21. Debes A., Chakraborty S., Ali M., Sack D. A.(2014), Manual for detecting Vibrio cholerae O1 and O139 from Fecal sample and from environmental water using a dipstick assay, the DOVE Project,based in the Department of
International Health, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health.
22. Fields P. I., Popovis T., Wachsmuth K. and Olsvik O. (1992), “Use of Polymerase Chain Reaction for Detection of Toxigenic Vibrio cholerae 01
Strains from the Latin American Cholera Epidemic”, Journal of Clinical Microbiology, 30(8), pp. 2118-2121.
23. Hasan J. A. K., Bernstein D., Huq A., Loomis L., Tamplin M., Colwell R. (1994), “Cholera DFA: An improved direct fluorescent monoclonal antibody staining kit for rapid detection and enumeration of V. cholerae O1”, FEMS Microbiology Letters, 120(1-2), pp. 143–148.
24. Hasan J., Huq A., Nair G., Garg S., Mukhopadhyay A., Loomis L., Bernstein D., Colwell R. (1995), “Development and testing of monoclonal antibody-based rapid immunodiagnostic test kits for direct detection of Vibrio cholerae O139 synonym Bengal”, Journal of Clinical Microbiology, 33(11), pp. 2935–2939.
25. Hasan J., Loomis L., et al. (1992), Development of a fast, simple, and sensitive immunoassay to detect Vibrio cholerae O1 from clinical samples using SMART™ Kit, American Society for Microbiology, New Orleans, LA, USA. 92nd.
26. Hoshino K., Yamasaki S., Mukhopadhyay A., Chakraborty S., Basu A., Bhattacharya S., Nair G., Shimada T., Takeda Y. (1998), “Development and evaluation of a multitest PCR assay for rapid detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139”, FEMS Immunology & Medical Microbiology, 20(3), pp. 201–207.
27. Howard-Jones N. (1984), "Robert Koch and the cholera vibrio: a centenary",
British Medical Journal, 288 (6414) , pp. 379-81.
28. Huq A., Colwell R., Rahman R., Ali A., Chowdhury M., Parveen S., Sack D., Russek-Cohen E. (1990), “Detection of Vibrio cholerae O1 in the aquatic
environment by fluorescent monoclonal antibody and culture method”, Applied
and Environmental Microbiology, 56(8), pp. 2370–2373.
29. Huq A., Haley B. J., Taviani E., Chen A., Hasan N. A., Colwell R. R. (2012), “Detection, Isolation, and Identification of Vibrio cholerae from the
Environment”, Current Protocols in Microbiology, chapter: Unit6A.5.
30. Keasler S. P., Hall R. H. (1993), “Detecting and biotyping Vibrio cholerae O1
with multiplex polymerase chain reaction”, Lancet, 341(8861), pp. 1661.
31. Kim M., Oh H. S., Park S. C., Chun J. (2014), “Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 64(Pt 2), pp. 346-51.
32. Kim Y. K., Lim S. I., Cho I. S., Cheong K. M., Lee E. J., Lee S., Kim J., Kim J., Jeong D., An B., An D. (2015), “A novel diagnostic approach to detecting porcine epidemic diarrhea virus: the lateral immunochromatography assay”,
Journal of virological methods, 225, pp. 4–8.
33. Kogure K., Simidu U., Taga N. (1979), “A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria”, Canadian Journal of Microbiology, 25(3), pp. 415–20.
34. Margosch D., Moravek M., Gaenzle M. C., Maertlbauer E., Vogel R F., and Ehrmann M. A. (2005), “Effect of High Pressure and Heat on Bacterial Toxins”, Food Technology and. Biotechnology, 43(3), pp. 211–217.
35. Nandi B., Nandy R., Mukhopadhyay S., Nair G., Shimada T., Ghose A. (2000), “Rapid method for species-specific identification of Vibrio cholerae using primers targeted to the gene of outer membrane protein”, Journal of Clinical Microbiology, 38(11), pp. 4145–4151.
36. Parija S. C. (2014), Textbook of Microbiology & Immunology, Elsevier Health Sciences.
37. Raphael C. W., Harley Y. T. (2009), Lateral Flow Immunoassay, Springer
Science + Business Media, Book: 223.
38. Ren M., Xu H., Huang X., Kuang M., Xiong Y., Xu H., Chen H., Wang A. (2014), “Immunochromatographic assay for ultrasensitive detection of aflatoxin B(1) in maize by highly luminescent quantum dot beads”, ACS Applied Materials and Interfaces, 6(16), pp. 14215–14222.
39. Rivas L., Alfredo de la Escosura-Muñiz, Serrano L., Altet L., Francino O., Armand Sánchez, and Arben Merkoỗ (2015), Triple lines gold nanoparticle- based lateral flow for enhanced and simultaneous Leishmania DNA detection of Leishmania DNA and endogenous control”, Nano Research, 8(11), pp. 3704-3714.
40. Rivera I. N., Chun J., Huq A., Sack R. B., Colwell R. R. (2001), “Genotypes associated with virulence in environmental isolates of Vibrio cholerae”, Applied and Environmental Microbiology, 67(6), pp. 2421-2429.
41. Roszak D., Colwell R. (1987), “Survival strategies of bacteria in the natural environment”, Microbiological Reviews, 51(3), pp. 365–379.
42. Sack R., Siddique A., Nizam A., Yunus M., Islam M, Morris J., Ali A., Huq A., Nair G., Qadri F., Faruque S., Sack D. (2003), “A 4-Year Study of the Epidemiology of Vibrio cholerae in Four Rural Areas of Bangladesh”, Journal
of Infectious Diseases, 187(1), pp. 96–101.
43. Schramm E. C., Staten N. R., Zhang Z., Bruce S. S., Kellner C., Atkinson J. P. Kyttaris V., Tsokos G., Petri M., Sander C. E., Olson P. (2015), “A quantitative lateral flow assay to detect complement activation in blood”, Analytical Biochemistry, 477, pp. 78–85.
44. Shirai H., Nishibuchi M., Ramamurthy T., Bhattacharya S. K., Pal S. C., and Takeda Y. (1991), “Polymerase chain reaction for detection of the cholera
enterotoxin operon of Vibrio cholerae”, Journal of Clinical Microbiology,
29(11), pp. 2517-2521.
45. Shukla S., Leem H., Lee J., Kim M. (2014), “Immunochromatographic strip assay for the rapid and sensitive detection of Salmonella Typhimurium in
artificially contaminated tomato samples”, Canadian Journal of Microbiology,
60(6), pp. 399-406.
46. Smith D. C., Lord J. M., Roberts L. M., Johannes L. (2004), “Glycosphingolipids as toxin receptors”, Seminars in Cell & Developmental Biology, 15(4), pp. 397–408.