Cố định kháng thể lên màng nitrocellulose

CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.4. Chế tạo que thử phát hiện V cholerae trong nguồn nƣớc sinh hoạt

3.4.1. Cố định kháng thể lên màng nitrocellulose

Trong 03 loại kháng thể đƣợc dùng để chế tạo que thử, kháng thể KT3 đƣợc lựa chọn để phun lên trƣớc trên màng nitrocellulose. Do kháng thể này đƣợc gắn enzyme peroxidase củ cải ngựa (HRP) có khả năng thủy phân cơ chất 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine (TMB) để tạo thành sản phẩm có màu xanh nên TMB đƣợc sử dụng để kiểm tra kết quả cố định kháng thể lên màng nitrocellulose.

Kháng thể KT3 đƣợc cố định lên màng nitrocellulose với lƣợng 0,3 µg/mm. Kết quả kiểm tra sự cố định kháng thể trên màng cho thấy, ngay sau khi nhỏ 10 µl cơ chất TMB lên màng nitrocellulose thì xuất hiện vạch màu xanh, gọn, rõ nét tại vị trí phun KT3 (Hình 3.9). Điều này chứng tỏ KT3 đã đƣợc phun và cố định tốt trên màng, giữ đƣợc hoạt tính. Từ kết quả này, các kháng thể KT1 và KT2 lần lƣợt đƣợc cố định lên màng nitrocellulose tại vị trí vạch thử nghiệm, giữ vai trị là kháng thể

bắt giữ. Trong đó, que thử loại 1: KT3 đƣợc cố định tại vị trí vạch kiểm chứng, KT2 đƣợc cố định tại vị trí vạch thử nghiệm; que thử loại 2: KT3 đƣợc cố định tại vị trí vạch kiểm chứng và KT1 đƣợc cố định tại vị trí vạch thử nghiệm.

a b

Hình 3.9: Hình ảnh cố định kháng thể KT3 lên màng nitrocellulose

a. Màng không đƣợc cố định KT3 + TMB b. Màng đƣợc cố định KT3 + TMB

3.4.2. Tạo dung dịch hạt vàng có kích thước nano và cộng hợp vào kháng thể

Kết quả tạo hạt nano vàng cho (Hình 3.10) cho thấy, trong điều kiện đun sơi kết hợp khuấy từ, dung dịch HAuCl4 0,1% sau khi đƣợc bổ sung natri citrate 1% đã có sự thay đổi màu theo thời gian, từ màu vàng nhạt sang màu đỏ rƣợu vang. Điều này chứng tỏ quá trình khử hạt vàng đã diễn ra và màu sắc của dung dịch thay đổi là do kích thƣớc của hạt vàng nhỏ dần. Kết quả soi hạt vàng dƣới kính hiển vi điện tử cho thấy, các hạt vàng có kích thƣớc khá đồng đều với đƣờng kính trung bình khoảng 20 nm (Hình 3.11).

Hình 3.10: Quá trình tạo dung dịch hạt vàng có kích thƣớc nano

Hình 3.11: Hình ảnh hạt vàng soi dƣới kính hiển vi điện tử

Các hạt vàng tiếp tục đƣợc cộng hợp vào kháng thể KT1 (ABIN1825015) và KT2 (ABIN1825014). Kết quả đƣợc kiểm tra bằng phản ứng giữa kháng thể cộng hợp vàng và vạch kiểm chứng (đã cố định kháng thể KT3) trên màng nitrocellulose bằng cách nhỏ 8 µl kháng thể KT1 (hoặc kháng thể KT2) cộng hợp vàng 20 µg/ml lên que thử.

Tuy nhiên, khi nhỏ hai kháng thể này lên màng đều có hiện tƣợng dung dịch kháng thể bị tắc ở đầu que thử và không thể tiếp tục di chuyển lên phía trên của màng nitrocellulose (Hình 3.12a, b). Nguyên nhân có thể là do trên bề mặt màng cịn có nhiều vị trí tƣơng tác ion dẫn đến việc cản trở sự di chuyển của các phân tử kháng thể. Do đó, màng cần đƣợc xử lý nhằm phủ kín các khe trên màng. Dung dịch thƣờng đƣợc sử dụng để xử lý màng là sữa gầy hay dung dịch BSA 1% [3]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các dung dịch để block màng nhƣ sữa gầy, dung dịch PBS chứa BSA 1% và dung dịch block mua sẵn. Sau khi cố định , rửa màng và để khơ để phủ kín các vị trí tƣơng tác ion trên màng, màng đƣợc sử

dụng để thấm hút dung dịch kháng thể cộng hợp vàng. Kết quả nhận đƣợc cho thấy dung dịch đệm PBS chứa BSA 1% và dung dịch cố định mua sẵn đều cho băng gọn, rõ nét, các kháng thể cộng hợp vàng không bị phân tán. Dung dịch sữa gầy cũng giúp màng khơng bị tắc nhƣng vạch khơng rõ. Do đó, xét về mặt hiệu quả và kinh tế, dung dịch đêm PBS chứa 1% BSA đƣợc lựa chọn để cố định màng sau khi phun kháng thể tại vị trí vạch T, C trên màng nitrocellulose. Tuy nhiên, sau khi cố định bằng dung dịch đệm, tốc độ thấm hút của màng trở nên kém hơn. Kết quả này có thể do bản thân màng nitrocellulose là chất kỵ nƣớc nên trong quá trình sản xuất đã đƣợc bổ sung thêm chất hoạt động bề mặt để màng có khả năng thấm hút nƣớc. Sau khi rửa màng, các chất hoạt động bề mặt mất dần đi làm cho màng khó thấm hút nƣớc và tốc độ di chuyển chậm [3, 37]. Do đó, chúng tơi tiến hành rửa màng bằng dung dịch đệm phosphate 0,01 M, pH 7,4, có chứa SDS 0,05% để tăng khả năng thấm hút của màng (SDS là một chất hoạt động bề mặt có vai trò làm giảm các tƣơng tác không đặc hiệu trên màng và thúc đẩy sự tái thấm của màng...). Nhƣ vậy, qua 2 bƣớc xử lý với BSA và SDS sau khi cố định kháng thể lên màng nitrocellulose thì màng có thể thấm hút tốt dung dịch kháng thể cộng hợp vàng và tạo thành vạch màu đỏ tại vị trí cố định kháng thể KT3 (Hình 3.12c, d).

Kết quả cho thấy, kháng thể KT1 và KT2 đã đƣợc gắn thành công vào hat nano vàng và đều có thể giữ vai trị làm kháng thể phát hiện. Do vậy, cần tiếp tục nghiên cứu để đánh giá khả năng phát hiện của hai kháng thể này khi thử nghiệm que thử.

Kết quả này cũng một lần nữa khẳng định kháng thể KT3 đã đƣợc cố định tốt trên màng nitrocellulose, tạo thành vạch gọn, rõ và giữ đƣợc hoạt tính.

Dựa vào những kết quả đạt đƣợc, chúng tôi tiếp tục tiến hành tối ƣu lƣợng kháng thể cố định lên vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm.

a b c d

Hình 3.12: Phản ứng giữa kháng thể cộng hợp vàng và vạch kiểm chứng trên

màng nitrocellulose

a: Màng chƣa xử lý + Kháng thể KT1 b: Màng chƣa xử lý + Kháng thể KT2 c: Màng đã xử ký + Kháng thể KT1 d: Màng đã xử lý + Kháng thể KT2

3.4.3. Tối ưu nồng độ kháng thể gắn lên vạch kiểm chứng

Kháng thể KT3 đƣợc cố định lên màng nitrocellulose với các nồng độ khác nhau (0,05 µg/mm; 0,1 µg/mm; 0,2 µg/mm và 0,3 µg/mm) để lựa chọn lƣợng kháng thể thấp nhất dùng cho một que thử mà vạch kiểm chứng vẫn xuất hiện rõ. Sau khi đã cố định KT3, các que thử đƣợc nhỏ trực tiếp 10 µl KT1 cộng hợp vàng 20 µg/ml vào đầu của mỗi que. Kết quả cho thấy rằng, sau khoảng 1 phút vạch kiểm chứng xuất hiện rõ ở que thử số 3, 4 còn que thử số 1 và 2 vạch có xuất hiện nhƣng khơng đƣợc rõ nét (Hình 3.13). Để tiết kiệm chi phí cho việc sản xuất que thử, trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tơi đã lựa chọn nồng độ KT3 sử dụng cho mỗi lần cố định lên màng nitrocellulose là 0,2 µg/mm. Đối với que thử có chiều rộng là 3 mm thì tƣơng đƣơng với lƣợng kháng thể là 0,6 µg/que. Trong nghiên cứu của Trần Thị Sao Mai và cộng sự (2015), kháng thể IgY kháng BSA đã đƣợc sử dụng làm kháng thể phun tại vị trí vạch kiểm chứng với nồng độ tối ƣu là 0,3 µg/mm tƣơng dƣơng với 1,2 µg/que thử rộng 4mm.

1 2 3 4 5

Hình 3.13: Kết quả tối ƣu lƣợng kháng thể cố định tại vị trí vạch kiểm chứng

1. Nồng độ kháng thể là 0 µg/mm 2. Nồng độ kháng thể là 0,05 µg/mm 3. Nồng độ kháng thể là 0,1 µg/mm 4. Nồng độ kháng thể là 0,2 µg/mm 5. Nồng độ kháng thể là 0,3 µg/mm

3.4.4. Tối ưu nồng độ kháng thể gắn lên vạch thử nghiệm

Sau khi lựa chọn đƣợc lƣợng kháng thể cố định lên vạch kiểm chứng, chúng tôi tiếp tục tối ƣu lƣợng kháng thể cố định lên vạch thử nghiệm với phƣơng pháp cụ thể là: KT3 đƣợc cố định lên màng nitrocellulose tại vị trí vạch kiểm chứng với lƣợng 0,2 µg/mm. Đồng thời KT1 hoặc KT2 đƣợc cố định tại vị trí vạch thử nghiệm với các nồng độ khác nhau là: 0,05 µg/mm; 0,1 µg/mm; 0,2 µg/mm và 0,3 µg/mm. Sau đó, que thử đƣợc nhúng vào giếng có chứa dung dịch bao gồm: 10 µl dịch ni vi khuẩn V. chlerae 108 CFU/ml và 10 µl KT2 cộng hợp vàng 20 µg/ml đối với que thử có vạch thử nghiệm là KT1 hoặc 10 µl KT1 cộng hợp vàng 20 µg/ml đối với que thử có vạch thử nghiệm là KT2. Kết quả cho thấy rằng, lƣợng kháng thể KT1 thấp nhất dùng cho vạch thử nghiệm là 0,2 µg/mm tƣơng đƣơng với 0,6 µg/que thử có độ rộng 3 mm (Hình 3.14). Kết quả tƣơng tự cũng đƣợc ghi nhận đối với vạch thử nghiệm là kháng thể KT2.

1 2 3 4 5

Hình 3.14: Kết quả tối ƣu lƣợng kháng thể cố định tại vị trí vạch thử nghiệm

1. Nồng độ kháng thể là 0 µg/mm 2. Nồng độ kháng thể là 0,05 µg/mm 3. Nồng độ kháng thể là 0,1 µg/mm 4. Nồng độ kháng thể là 0,2 µg/mm 5. Nồng độ kháng thể là 0,3 µg/mm

Kết quả nghiên cứu tối ƣu nồng độ của kháng thể của chúng tôi cũng khá phù hợp với kết quả đã công bố trong nghiên cứu của Trần Thị Sao Mai và cộng sự [3] về xác định lƣợng kháng thể IgY kháng độc tố tụ cầu vàng (SEA, SEB, SEC, SED và SEE) cần cố định tại vị trí vạch thử nghiệm là 0,6 µg/que thử rộng 4 mm.

3.4.5. Đánh giá một số chỉ tiêu kỹ thuật của que thử

3.4.5.1. Đánh giá ngưỡng và thời gian phát hiện của que thử

Sau khi tạo đƣợc 2 loại que thử (bao gồm màng nitrocellulose và màng thấm hút trên): Loại 1 (dùng KT1 làm kháng thể phát hiện và KT2 làm kháng thể bắt giữ) và loại 2 (ngƣợc lại so với que thử loại 1), chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng phát hiện vi khuẩn V. cholerae chuẩn (ATCC 9458) của 2 loại que thử này. Kết quả cho thấy, cả hai loại que thử đều có khả năng phát hiện vi khuẩn V. cholerae, các vạch màu bắt đầu xuất hiện sau 1 phút và trở nên rõ nét sau 5 phút. Tuy nhiên, que thử loại 1 cho phép phát hiện ở ngƣỡng nồng độ 105 CFU/ml (Hình 3.15), trong khi que thử loại 2 chỉ phát hiện đến 106 CFU/ml, thời gian phát hiện từ 2 - 5 phút (Hình 3.16). Kết quả này phù hợp với kết quả tăng sinh tế bào vi khuẩn V. cholerae, sau 6

- 8 giờ nuôi cấy số lƣợng tế bào đạt đƣợc từ 106 -107 CFU/ml.

Vạch C Vạch T

Que thử loại 1 tiếp tục đƣợc thử nghiệm với các chủng V. cholerae O1 và chủng V. cholerae HP trong môi trƣờng pepton kiềm và trong nƣớc sinh hoạt. Kết quả cho thấy, que thử đều cho kết quả dƣơng tính đối với các mẫu chứa vi khuẩn V.

cholerae trên 105 CFU/ml (Bảng 3.1).

Nhƣ vậy, nếu sử dụng trực tiếp que thử để phát hiện vi khuẩn V. cholerae thì chỉ có thể phát hiện đến 105 CFU/ml. Trong khi, với nồng độ vi khuẩn tả trong ruột đạt khoảng 102 - 103 CFU/ ml là đã có thể gây bệnh [2]. Chính vì vậy, bƣớc tiến hành nuôi cấy tăng sinh tế bào vi khuẩn trong môi trƣờng pepton kiềm là rất quan trọng, làm tăng độ nhạy của que thử, cụ thể que thử có thể phát hiện đƣợc mẫu chứa vi khuẩn V. cholerae có nồng độ từ 3 - 4 CFU/ml sau 6 - 8 giờ.

Hình 3.15: Kết quả đánh giá ngƣỡng phát hiện của que thử loại 1 (dùng KT1 làm kháng

thể phát hiện và KT2 làm kháng thể bắt giữ)

108 107 106 105 0 CFU/ml

Bảng 3.1: Kết quả đánh giá ngƣỡng phát hiện của que thử loại 1

đối với 03 chủng V. cholerae

Môi trƣờng Pepton kiềm Nƣớc sinh hoạt

Nồng độ (CFU/ml) 108 107 106 105 104 107 106 105 104

V. cholerae chuẩn 3/3 3/3 3/3 3/3 1/3 3/3 3/3 3/3 0/3 V. cholerae O1 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3/3 3/3 3/3 0/3 V. cholerae HP 3/3 3/3 3/3 3/3 0/3 3/3 3/3 3/3 0/3

Số que thử dƣơng tính (lặp lại 03 lần)

Kết quả đánh giá ngƣỡng phát hiện của que thử trong nghiên cứu này cũng khá tƣơng đồng với kết quả nghiên của Chakraborty và cộng sự với ngƣỡng phát hiện là 107 CFU/ml, đối với các mẫu có nồng độ < 10 CFU/ml thì cần ni cấy tăng sinh trong môi trƣờng pepton kiềm trong 24 giờ để phát hiện [12]; Amanda Debes và cộng sự đã tạo thành công que thử có ngƣỡng phát hiện là 106 CFU/ml đối với chủng V. cholerae O1 và 107 CFU/ml đối với chủng V. cholerae O139 với thời gian phát hiện 5-10 phút. Để đảm bảo một mẫu dƣơng tính cho kết quả đúng thì mẫu đƣợc ủ trong môi trƣờng pepton kiềm từ 5-8 tiếng để khuếch đại tín hiệu bằng cách tăng nồng độ vi khuẩn trong mẫu [21].

3.4.5.2. Đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật của que thử

Độ đặc hiệu của que thử đƣợc đánh giá qua khả năng có phản ứng chéo với các vi khuẩn khác. Các vi khuẩn đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đánh giá độ đặc hiệu của que thử là một số vi khuẩn gây bệnh nhƣ Salmonella, Shigella, Listeria, Klebsiella, S. aureus và E. coli. Độ đặc hiệu kỹ thuật của que thử là tỷ lệ phần trăm

giữa số que thử âm tính với các vi khuẩn khác trên tổng số que thử thử nghiệm. Kết quả về độ đặc hiệu của que thử phát hiện V. cholerae đƣợc trình bày trên Bảng 3.2 và Hình 3.17.

Bảng 3.2. Độ đặc hiệu của que thử phát hiện V. cholerae Số que thử dƣơng tính

(3 lần lặp lại)

Chủng Salmonella Shigella Listeria Klebsiella S. aureus E. coli

Que thử

V. cholerae 0/3 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3

1 2 3 4 5 6

Hình 3.17. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của que thử phát hiện V. cholerae

(1: Salmonella, 2: Shigella, 3: Listeria, 4: Klebsiella, 5: S. aureus, 6: E. coli)

Kết quả trình bày trên Bảng 3.2 cho thấy với 18 que thử phát hiện V. cholerae về khả năng phản ứng chéo với các vi khuẩn khác (3 que/loại vi khuẩn), có

1 que cho kết quả dƣơng tính với vi khuẩn Klebsiella, 17 que cho kết quả âm tính. Từ đó, có thể xác định độ đặc hiệu kỹ thuật của que thử trong thử nghiệm này là 17/18 = 0,94 tƣơng đƣơng 94%. Trong nghiên cứu của Debes và công sự [21], độ đặc hiệu của que thử phát hiện vi khuẩn V. cholerae cũng đã đƣợc xác định khi sử

dụng trực tiếp với các mẫu phân của bệnh nhân là 60% - 70%. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu này khá thấp cho thấy cần phải có sự cải tiến trong q trình xét nghiệm để hạn chế kết quả dƣơng tính giả. Trên thực tế, có nhiều cơng trình nghiên cứu chế tao que thử bằng phƣơng pháp sắc ký miễn dịch để sử dụng cho các xét nghiệm tƣơng tự có độ đặc hiệu cao, do bản chất của cơ chế hoạt động của que thử là dựa trên

tƣơng tác đặc hiệu sinh học giữa kháng nguyên và kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên. Trong một nghiên cứu đánh giá độ đặc hiệu của 3 bộ xét nghiệm thƣơng mại để phát hiện loài Cryptosporidium ở động vật, kết quả cho thấy phƣơng pháp sắc ký miễn dịch có độ đặc hiệu 100% trong khi 2 phƣơng pháp còn lại là EIA (enzyme immunoassay) và ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) có độ đặc hiệu lần lƣợt là 75.9% và 78.9% [20].

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu chúng tôi rút ra một số kết luận sau đây:

1. Đã phân lập đƣợc 01 chủng vi khuẩn có trình tự gen 16S rRNA tƣơng đồng 99% với trình tự gen của V. cholerae từ mẫu nƣớc đầm tơm ở Hải Phịng.

2. Đã lựa chọn đƣợc mơi trƣờng peton kiềm thích hợp cho việc tăng sinh của vi khuẩn V. cholerae sau 8 giờ nuôi cấy, số lƣợng tế bào vi khuẩn có thể tăng từ 3- 4 CFU/ml lên đến 106 - 107 CFU/ml.

3. Đã bƣớc đầu chế tạo thành công que thử gồm: màng nitrocellulose và màng thấm hút trên, có kích thƣớc 3mm x 5 cm, với vạch kiểm chứng là kháng thể đa dòng kháng IgG của chuột gắn enzyme peroxidase (Ab6789_Abcam) có nồng độ tối ƣu là 0,2 µg/mm và kháng thể tại vạch thử nghiệm là kháng thể đơn dòng kháng V. cholerae gây trên chuột (ABIN1825015) có nồng độ tối ƣu là 0,2 µm/mm. Kháng thể phát hiện dùng cho que thử là kháng thể đơn dòng kháng V.