CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.9. Phân tích mẫu bằng que thử
Mỗi mẫu phân tích đƣợc nhiễm chủ động vi khuẩn V. cholerae với liều lƣợng
vào giếng ELISA. Sau đó, kháng thể cộng hợp với hạt vàng đƣợc bổ sung một lƣợng nhất định và cắm que thử vào giếng. Kết quả phân tích đƣợc đánh giá dựa vào việc xuất hiện vạch trên que thử và đƣợc coi là dƣơng tính nếu xuất hiện cả 2 vạch, là âm tính nếu chỉ xuất hiện vạch kiểm chứng và khơng có giá trị nếu chỉ xuất hiện vạch thử nghiệm hoặc khơng có vạch nào xuất hiện [3].
2.3.10. Phương pháp xác định ngưỡng và thời gian phát hiện của que thử
Dịch ni vi khuẩn V. cholerae có nồng độ 108 CFU/ml đƣợc pha lỗng về 104 - 107 trong mơi trƣờng pepton kiềm pH 8,5 và trong nƣớc sinh hoạt. Sau đó, que thử đƣợc nhúng lần lƣợt vào 100 µl dung dịch có chứa V. cholerae với nồng độ khác nhau, bổ sung thêm 8 µl kháng thể cộng hợp vàng 20 µg/ml.
+ Xác định ngƣỡng phát hiện của que thử: là nồng độ V. cholerae thấp nhất mà que thử có thể phát hiện đƣợc.
+ Xác định thời gian phát hiện của que thử: theo dõi thời gian xuất hiện vạch màu trên que thử trong 1, 2, 5, 7, 10, 12 và 15 phút. Thời gian ngắn nhất mà vạch màu xuất hiện rõ trên que thử đƣợc xác định là thời gian phát hiện của que thử.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại với 03 chủng (V. cholerae chuẩn, V. cholerae O1 và
V. cholerae HP) và mỗi chủng đƣợc lặp lại ít nhất 03 lần [12, 21, 48].
2.3.11. Xác định độ đặc hiệu của que thử
Đánh giá độ đặc hiệu với một số chủng vi khuẩn chuẩn gây bệnh khác nhƣ
Samonella, Shigella, E. coli, Listeria, S. aureus, Klebsiella. Các mẫu vi khuẩn
chuẩn đƣợc cấy trên môi trƣờng dịch tƣơng ứng đến nồng độ 106 – 107 CFU/ml. Que thử đƣợc nhúng vào 100 µl dịch ni mỗi loại vi khuẩn và 8 µl kháng thể cộng hợp vàng 20 µg/ml. Kết quả đƣợc đọc sau 5 phút. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 03 lần. Độ đặc hiệu của que thử đƣợc đánh giá thơng qua tỷ lệ các mẫu âm tính đối với các vi khuẩn khác nhau [48].
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập vi khuẩn V. cholerae 3.1. Phân lập vi khuẩn V. cholerae
3.1.1. Phân lập vi khuẩn V. cholerae từ một số nguồn ô nhiễm
Để phân lập vi khuẩn V. cholerae từ các mẫu nƣớc, chúng tôi đã lấy 10 ml
mẫu nƣớc chứa vi khuẩn, làm giàu 03 lần liên tiếp trong môi trƣờng pepton pH 8,5 nhằm hạn chế sự phát hiện của một số vi khuẩn khác trong mơi trƣờng nghèo dinh dƣỡng có pH kiềm, đồng thời làm tăng mật độ của vi khuẩn V. cholerae trong dịch nuôi cấy. Kết quả cấy trải dịch nuôi vi khuẩn trên môi trƣờng chọn lọc TCBS (Hình 3.1) cho thấy, cả 3 đĩa thạch đều thu đƣợc khuẩn lạc màu vàng đặc trƣng của vi khuẩn V. cholerae. Trong đó, 01 mẫu là vi khuẩn V. cholerae O1 và 02 mẫu là vi
khuẩn đƣợc phân lập từ mơi trƣờng tự nhiên.
Hình 3.1: Sự phát triển của vi khuẩn V. cholerae trên môi trƣờng thạch TCBS
(A: Mẫu nƣớc đầm tơm Hải Phịng; B: Mẫu nƣớc thốt cống Hà Nội; C: Vi khuẩn V. cholerae O1)
3.1.2. Xác định trình tự gen 16S rARN của chủng vi khuẩn phân lập được
Vì mơi trƣờng TCBS có cũng cho phép một số vi khuẩn khác phát triển nhƣ:
Vibrio parahaemolyticus, Vibrio fischeri, Pseudomonas.... Vì vậy, để khẳng định chắc chắn chủng vi khuẩn đã đƣợc phân lập là V. cholerae, chúng tôi đã tiến hành nhân đoạn gen 16S rRNA bằng phƣơng pháp PCR đối với các khuẩn lạc riêng rẽ trên mỗi đĩa, sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và gửi đi xác định trình tự nucleotide để định danh vi khuẩn. Đồng thời, khuẩn lạc cũng đƣợc cấy chuyển và nuôi lỏng trong môi trƣờng pepton kiềm (Do vi khuẩn này chỉ tồn tại trên TCBS khoảng 1 tuần).
1 M 2 3
tổng số của vi khuẩn đƣợc điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra. Kết quả cho thấy (Hình 3.2), chúng tơi đã tách chiết đƣợc DNA tổng số của 03 chủng vi khuẩn. Các mẫu này tiếp tục đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.
.
Hình 3.2: Kết quả tách chiết DNA tổng số
(M: Marker 1 kb; 1: Vibrio cholerae O1; 2: Vi khuẩn phân lập từ mẫu nƣớc Đầm tơm Hải Phịng; 3: Vi khuẩn phân lập từ mẫu nƣớc thoát Hà Nội)
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc điện di trên gel agarose 1%, thu đƣợc các băng có kích thƣớc khoảng 1,5 kb tƣơng đƣơng với kích thƣớc gen 16S rRNA của vi khuẩn V. cholerae (Hình 3.3). Sau đó, sản phẩm PCR đƣợc làm sạch và gửi đi giải trình tự 16S rRNA. Trình tự thu đƣợc này sẽ đƣợc so sánh với các trình tự 16S rRNA khác trên ngân hàng gen (sử dụng phần mềm Blast của NCBI). Kết quả nhận đƣợc cho thấy rằng, 02 trong 03 mẫu phân lập đƣợc là V. cholerae O1 và vi khuẩn phân lập đƣợc từ nƣớc đầm tơm Hải Phịng có độ tƣơng đồng 99% so với trình tự gen 16S rRNA của V. cholerae trên ngân hàng gen (NR_044853.1). Do vậy, vi khuẩn phân lập đƣợc từ nƣớc đầm tơm Hải Phịng đƣợc đặt tên là V. cholerae HP. Trong khi đó, vi khuẩn đƣợc phân lập từ mẫu nƣớc thốt chỉ tƣơng đồng 65% (Hình 3.4). Từ kết quả này, 02 chủng vi khuẩn bao gồm V. cholerae O1 và V. cholerae HP đƣợc tiếp tục sử dụng cho các thử nghiệm đánh giá khả năng phát hiện của que thử.
Hình 3.3: Kết quả nhân bản gen 16S rRNA của vi khuẩn V. cholerae
(M: Marker 1 kb; 1: Đối chứng âm; 2: Vi khuẩn phân lập từ mẫu nƣớc Đầm tôm Hải Phòng; 3: Vi khuẩn phân lập từ mẫu nƣớc thoát Hà Nội; 4: Vibrio cholerae O1)
TT Tên mẫu Len(nt) TT Tên mẫu Kích thước Độ tương đồng 1 NR_044853.1 1538 2 Mau_Benhvien103 1233 99% 1 NR_044853.1 1538 3 Mau_DamtomHP 1014 99% 1 NR_044853.1 1538 4 Mau_NuocthoatHN 1096 65%
Hình 3.4: Kết quả so sánh trình tự nucletide của gen 16S rRNA từ các mẫu vi
khuẩn phân lập đƣợc với trình tự nucleotide tƣơng ứng (NR_044853.1) trên ngân hàng gen thế giới (sử dụng phần mềm ClustalW)
NR_044853.1: Trình tự gen của Vibrio cholerae chủng CECT 514 lấy từ Ngân hàng gen thế giới, các mẫu còn lại đƣợc lấy trong nghiên cứu này.
3.2. Xác định môi trƣờng dùng để tăng sinh tế bào vi khuẩn V. cholerae
Theo các kết quả nghiên cứu trƣớc đây, ngƣỡng phát hiện vi khuẩn V. cholerae của que thử là từ 106 - 107 CFU/ml [12, 21]. Tuy nhiên, trong các mẫu nƣớc sinh hoạt và các mẫu thực phẩm, số lƣợng vi khuẩn tả bị nhiễm thƣờng thấp hơn 104 CFU/ml. Do đó, để đáp ứng nhu cầu phát hiện vi khuẩn ngay tại điều kiện hiện trƣờng cần phải nuôi cấy để tăng sinh số lƣợng tế bào vi khuẩn này.
Kết quả nuôi tăng sinh đối với chủng V. cholerae chuẩn (ATCC 9458) cho
thấy vi khuẩn này có thể phát triển tốt ở cả 03 loại môi trƣờng: LB kiềm, canh thang kiềm và pepton kiềm. Tại thời điểm 0 giờ, lƣợng vi khuẩn có mặt ở cả 3 môi trƣờng khá đồng đều, khoảng 3 - 4 CFU/ml (tƣơng đƣơng với giá trị log[CFU/ml] là 0,4- 0,6) (Hình 3.5). Do vậy, có thể đảm bảo sự sai khác số lƣợng vi khuẩn sau thời gian tăng sinh tế bào là do ảnh hƣởng chủ yếu của môi trƣờng nuôi cấy. Sau 8 giờ, số lƣợng vi khuẩn V. cholerae trong cả 3 môi trƣờng đều đạt đến 106 - 107 CFU/ml. Tuy nhiên, pepton kiềm là mơi trƣờng có số lƣợng tế bào vi khuẩn nhiều nhất (Hình 3.5). Kết quả xác định mơi trƣờng dùng để tăng sinh tế bào vi khuẩn cũng thu đƣợc tƣơng tự đối với chủng V. cholerae O1 mua từ Bệnh viện 103 và chủng V. cholerae phân lập từ nƣớc đầm tơm Hải Phịng (Hình 3.6, 3.7). Đây cũng là mơi trƣờng hạn chế đƣợc sự phát triển của các vi khuẩn khác. Các nghiên cứu của các tác giả khác
Log [CFU/ml]
cholerae. Vì vậy, mơi trƣờng phù hợp nhất để tăng sinh vi khuẩn V. cholerae trong
03 loại môi trƣờng thử nghiệm là pepton kiềm. Với thời gian tăng sinh là 8 tiếng, số lƣợng tế bào vi khuẩn có thể tăng từ 3 - 4 CFU/ml lên đến 106 - 107 CFU/ml.
Hình 3.5: Sự tăng sinh tế bào của Vibrio cholerae chuẩn (ATCC 9458) trong
các môi trƣờng khác nhau
Vibrio cholerae chuẩn
Vibrio cholerae O1
Log [CFU/ml]
Giờ
Giờ
Hình 3.6: Sự tăng sinh tế bào của Vibrio cholerae O1
Log [CFU/ml]
Hình 3.7: Sự tăng sinh tế bào của Vibrio cholerae HP trong các môi trƣờng
khác nhau
Theo các nghiên cứu trƣớc, 106 - 107 CFU/ml là nồng độ mà que thử có thể phát hiện đƣợc dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch. Amanda Debes và cộng sự đã tạo thành công que thử có ngƣỡng phát hiện là 106 CFU/ml đối với chủng V. cholerae O1 và 107 CFU/ml đối với chủng V. cholerae O139 sau 5 - 8 giờ nuôi cấy [12]. Trong một số cơng trình đã cơng bố, môi trƣờng chủ yếu đƣợc lựa chọn để nuôi cấy vi khuẩn V. cholerae là pepton kiềm [12, 21] do vi khuẩn này có thể phát triển tốt trong mơi trƣờng nghèo dinh dƣỡng có pH từ 8,5 - 9. Vì vậy, chúng tơi lựa chọn môi trƣờng này để nuôi cấy V. cholerae trong các thử nghiệm tiếp theo.
3.3. Nghiên cứu lựa chọn cặp kháng thể phù hợp bằng phƣơng pháp ELISA để phát hiện vi khuẩn V. cholerae phát hiện vi khuẩn V. cholerae
Kết quả phân tích phản ứng giữa kháng nguyên O của V. cholerae và kháng
thể phát hiện bằng phƣơng pháp ELISA cho thấy, cả hai giếng ủ V. cholerae với
kháng thể đơn dòng đều xuất hiện màu vàng và có độ hấp thụ ở bƣớc sóng 450 nm tƣơng ứng là 0,352 và 0,245 (Hình 3.8), trong khi mẫu đối chứng âm cho tín hiệu rất thấp. Điều này chứng tỏ, hai loại kháng thể đơn dòng kháng V. cholerae là KT1
Vibrio cholerae HP
thể KT3. Kết quả này phù hợp với lý thuyết, KT3 là kháng thể đa dòng từ dê kháng lại IgG của chuột nên sẽ bắt cặp với KT1 và KT2 là 2 kháng thể đơn dịng có bản chất là IgG của chuột. Vì vậy, KT3 có thể đƣợc dùng làm kháng thể kiểm chứng. Tuy nhiên, để lựa chọn chính xác KT1 dùng làm kháng thể phát hiện và KT2 dùng làm kháng thể bắt giữ hoặc ngƣợc lại, chúng tôi đã tiến hành đồng thời cả hai trƣờng hợp trên để kiểm tra trong các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.8: Hình ảnh ELISA đánh giá sự bắt cặp giữa Vibrio cholerae và kháng
thể đặc hiệu
Giếng 1: BSA-KT1-KT3 Giếng 2: BSA-KT2-KT3
Giếng 2: Vibrio cholera-KT1-KT3 Giếng 3: Vibrio cholerae-KT2-KT3
3.4. Chế tạo que thử phát hiện V. cholerae trong nguồn nƣớc sinh hoạt
3.4.1. Cố định kháng thể lên màng nitrocellulose
Trong 03 loại kháng thể đƣợc dùng để chế tạo que thử, kháng thể KT3 đƣợc lựa chọn để phun lên trƣớc trên màng nitrocellulose. Do kháng thể này đƣợc gắn enzyme peroxidase củ cải ngựa (HRP) có khả năng thủy phân cơ chất 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine (TMB) để tạo thành sản phẩm có màu xanh nên TMB đƣợc sử dụng để kiểm tra kết quả cố định kháng thể lên màng nitrocellulose.
Kháng thể KT3 đƣợc cố định lên màng nitrocellulose với lƣợng 0,3 µg/mm. Kết quả kiểm tra sự cố định kháng thể trên màng cho thấy, ngay sau khi nhỏ 10 µl cơ chất TMB lên màng nitrocellulose thì xuất hiện vạch màu xanh, gọn, rõ nét tại vị trí phun KT3 (Hình 3.9). Điều này chứng tỏ KT3 đã đƣợc phun và cố định tốt trên màng, giữ đƣợc hoạt tính. Từ kết quả này, các kháng thể KT1 và KT2 lần lƣợt đƣợc cố định lên màng nitrocellulose tại vị trí vạch thử nghiệm, giữ vai trị là kháng thể
bắt giữ. Trong đó, que thử loại 1: KT3 đƣợc cố định tại vị trí vạch kiểm chứng, KT2 đƣợc cố định tại vị trí vạch thử nghiệm; que thử loại 2: KT3 đƣợc cố định tại vị trí vạch kiểm chứng và KT1 đƣợc cố định tại vị trí vạch thử nghiệm.
a b
Hình 3.9: Hình ảnh cố định kháng thể KT3 lên màng nitrocellulose
a. Màng không đƣợc cố định KT3 + TMB b. Màng đƣợc cố định KT3 + TMB
3.4.2. Tạo dung dịch hạt vàng có kích thước nano và cộng hợp vào kháng thể
Kết quả tạo hạt nano vàng cho (Hình 3.10) cho thấy, trong điều kiện đun sơi kết hợp khuấy từ, dung dịch HAuCl4 0,1% sau khi đƣợc bổ sung natri citrate 1% đã có sự thay đổi màu theo thời gian, từ màu vàng nhạt sang màu đỏ rƣợu vang. Điều này chứng tỏ quá trình khử hạt vàng đã diễn ra và màu sắc của dung dịch thay đổi là do kích thƣớc của hạt vàng nhỏ dần. Kết quả soi hạt vàng dƣới kính hiển vi điện tử cho thấy, các hạt vàng có kích thƣớc khá đồng đều với đƣờng kính trung bình khoảng 20 nm (Hình 3.11).
Hình 3.10: Quá trình tạo dung dịch hạt vàng có kích thƣớc nano
Hình 3.11: Hình ảnh hạt vàng soi dƣới kính hiển vi điện tử
Các hạt vàng tiếp tục đƣợc cộng hợp vào kháng thể KT1 (ABIN1825015) và KT2 (ABIN1825014). Kết quả đƣợc kiểm tra bằng phản ứng giữa kháng thể cộng hợp vàng và vạch kiểm chứng (đã cố định kháng thể KT3) trên màng nitrocellulose bằng cách nhỏ 8 µl kháng thể KT1 (hoặc kháng thể KT2) cộng hợp vàng 20 µg/ml lên que thử.
Tuy nhiên, khi nhỏ hai kháng thể này lên màng đều có hiện tƣợng dung dịch kháng thể bị tắc ở đầu que thử và không thể tiếp tục di chuyển lên phía trên của màng nitrocellulose (Hình 3.12a, b). Nguyên nhân có thể là do trên bề mặt màng cịn có nhiều vị trí tƣơng tác ion dẫn đến việc cản trở sự di chuyển của các phân tử kháng thể. Do đó, màng cần đƣợc xử lý nhằm phủ kín các khe trên màng. Dung dịch thƣờng đƣợc sử dụng để xử lý màng là sữa gầy hay dung dịch BSA 1% [3]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các dung dịch để block màng nhƣ sữa gầy, dung dịch PBS chứa BSA 1% và dung dịch block mua sẵn. Sau khi cố định , rửa màng và để khơ để phủ kín các vị trí tƣơng tác ion trên màng, màng đƣợc sử
dụng để thấm hút dung dịch kháng thể cộng hợp vàng. Kết quả nhận đƣợc cho thấy dung dịch đệm PBS chứa BSA 1% và dung dịch cố định mua sẵn đều cho băng gọn, rõ nét, các kháng thể cộng hợp vàng không bị phân tán. Dung dịch sữa gầy cũng giúp màng không bị tắc nhƣng vạch khơng rõ. Do đó, xét về mặt hiệu quả và kinh tế, dung dịch đêm PBS chứa 1% BSA đƣợc lựa chọn để cố định màng sau khi phun kháng thể tại vị trí vạch T, C trên màng nitrocellulose. Tuy nhiên, sau khi cố định bằng dung dịch đệm, tốc độ thấm hút của màng trở nên kém hơn. Kết quả này có thể do bản thân màng nitrocellulose là chất kỵ nƣớc nên trong quá trình sản xuất đã đƣợc bổ sung thêm chất hoạt động bề mặt để màng có khả năng thấm hút nƣớc. Sau khi rửa màng, các chất hoạt động bề mặt mất dần đi làm cho màng khó thấm hút nƣớc và tốc độ di chuyển chậm [3, 37]. Do đó, chúng tơi tiến hành rửa màng bằng dung dịch đệm phosphate 0,01 M, pH 7,4, có chứa SDS 0,05% để tăng khả năng thấm hút của màng (SDS là một chất hoạt động bề mặt có vai trị làm giảm các tƣơng tác khơng đặc hiệu trên màng và thúc đẩy sự tái thấm của màng...). Nhƣ vậy, qua 2 bƣớc xử lý với BSA và SDS sau khi cố định kháng thể lên màng nitrocellulose thì màng có thể thấm hút tốt dung dịch kháng thể cộng hợp vàng và tạo thành vạch màu đỏ tại vị trí cố định kháng thể KT3 (Hình 3.12c, d).
Kết quả cho thấy, kháng thể KT1 và KT2 đã đƣợc gắn thành công vào hat nano vàng và đều có thể giữ vai trị làm kháng thể phát hiện. Do vậy, cần tiếp tục nghiên cứu để đánh giá khả năng phát hiện của hai kháng thể này khi thử nghiệm que thử.
Kết quả này cũng một lần nữa khẳng định kháng thể KT3 đã đƣợc cố định tốt trên màng nitrocellulose, tạo thành vạch gọn, rõ và giữ đƣợc hoạt tính.