Thẩm tách loại muối
2.2.8.
Phân đoạn protein sau tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực trong 6M urea đƣợc thẩm tích lần lƣợt trong dung dịch đệm chứa 4 M và 2 M urea. Các bƣớc đƣợc thực hiện nhƣ sau: Dịch protein sau tinh sạch chứa 6M urea đƣợc đặt trong túi thẩm tích (SnakeSkin™ Dialysis Tubing, 10K MWCO, Thermo Scientific) và đƣơc thẩm tích 2 lần trong dung dịch đệm (20 mM Tris-HCl, pH 8 chứa 4 M urea), mỗi lần trong 1 giờ ở 4oC. Sau đó, túi thẩm tích chứa dung dịch protein đƣợc thẩm tích 2 lần trong dung dịch đệm (20 mM Tris-HCl, pH 8 chứa 2 M urea), mỗi lần trong 1 giờ ở 4oC. Cuối cùng, túi thẩm tích chứa protein đƣợc thẩm tích 2 lần trong dung dịch đệm 20 mM Tris-HCl, pH 8, không chứa urea, mỗi lần trong 1 giờ ở 4oC. Hàm lƣợng protein sau thẩm t ch đƣợc định lƣợng bằng máy nanodrop. Dịch protein sau thẩm t ch đƣợc bảo quản ở –80oC.
2.3. Một số phần mềm s dụng trong luận văn
Ngoài phần mềm excel đƣợc sử dụng cho các t nh tốn thơng thƣờng, trong luận văn còn sử dụng một số phần mềm sau:
- Phần mềm BLAST-online đƣợc dùng để kiểm tra trình tự nucleotide.
- Phần mềm ImageJ đƣợc sử dụng để đo độ sáng của băng điện di, từ đó suy ra nồng độ của mẫu nghiên cứu.
- Phần mềm GelQuant dùng để dự đoán k ch thƣớc băng đột biến giúp khẳng định kết quả.
- Phần mềm Design expert đƣợc sử dụng để phân t ch tìm ra điều kiện tối ƣu biểu hiện của protein tái tổ hợp.
3 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách dòng và biểu hiện đoạn gen mã hoá kháng nguyên 56 kDa trong E. Coli Khuếch đại các đoạn gen mã hoá kháng nguyên 56 kDa bằng phƣơng pháp PCR 3.1.1.
Bốn đoạn gen mã hoá vùng quyết định kháng nguyên 56 kDa của 4 nhóm Karp (HT09), Gilliam (HT11), TA763 (HT49) và Kato (YB50) của
O. tsutsugamushi có k ch thƣớc khoảng 1,2 kb đã đƣợc nhân lên bằng phản ứng
PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu P51KARPF và P51KARPR:
Hình 10: Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên 56
kDa trên gel agarose 1% . (M: thang chuẩn AND (Biolabs); (-) đối chứng âm; 1-4: gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa lần lƣợt HT09 (1), HT11 (2), HT49 (3) và YB50 (4)).
Theo tính tốn lý thuyết, sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi trên có k ch thƣớc khoảng 1,2 kb. Trong vịng PCR đầu tiên chúng tơi khơng quan sát thấy vạch băng ADN có k ch thƣớc 1,2 kb theo tính tốn. Sản phẩm PCR đầu tiên đƣợc sử dụng để làm ADN khuôn cho phản ứng PCR vòng hai. Kết quả cho thấy, sau lần PCR vòng hai, sản phẩm PCR là một vạch băng ADN đơn nhất, sắc nét, có k ch thƣớc khoảng 1,2 kb đúng nhƣ t nh tốn (hình 10). Lý giải cho điều này, có thể do ở thời điểm lấy mẫu, trong máu của bệnh nhân số lƣợng bản sao ADN của O. tsutsugamushi ít, sau 30 chu kỳ khuếch đại chƣa thể quan sát đƣợc sản phẩm PCR trên bản gel. Do vậy, khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa cần đƣợc thực hiện 2 bƣớc PCR, kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Yu-Mi Lee và cộng sự [18].
M (-) 1 2 3 4 0,5 1,0 1,5 2,0 1,2 kb
Tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa 3.1.2.
Sản phẩm PCR các đoạn gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa đƣợc tinh sạch và ghép nối vào plasmid pLATE51 sử dụng kit “aLICator LIC Cloning and Expression Kit 2”. Hỗn hợp plasmid pLATE51 và đoạn gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa sau phản ứng ghép nối đƣợc biến nạp vào tế bào tách dòng E. coli DH5α
bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Tế bào E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp
pLATE_56kDa đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng LB có chứa ampicillin.
Hình 11: Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc DH5α sau biến nạp mang plasmid
tái tổ hợp. pLATE_ht09 (A), pLATE_ht-11 (B), pLATE_ht49 (C), pLATE_yb50 (D). M: Thang chuẩn ADN (Biolabs), (-): Khuẩn lạc tế bào E. coli DH5α, đƣờng chạy 1-4:
Các khuẩn lạc tế bào E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp.
Để kiểm tra sự có mặt của plasmid tái tổ hợp pLATE_56kDa trong tế bào
E. coli, một số khuẩn lạc tế bào E. coli DH5α sau biến nạp đƣợc lựa chọn làm ADN
khuôn cho phản ứng PCR sử dụng cặp mồi LIC for và LIC rev. Theo tính tốn, tế bào E. coli mang plasmid tái tổ hợp pLATE_56kDa sẽ tạo ra sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 1,4 kb. Khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng sàng lọc đƣợc PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn chèn (hình 11) và giải trình tự bằng phƣơng pháp Sanger để kiểm tra. Kết quả giải trình tự cho thấy chủng HT09 chứa plasmid mang vector tái tổ hợp số 4 (kí hiệu HT09.2) đƣợc giải trình tự bằng phƣơng pháp Sanger. So với 2,0 1,0 M (-) 1 2 (-) M 1 2 M (-) 1 2 3 4 M (-) 1 2 3 1,5 2,5 1,4 kb A B C D
trình tự kháng nguyên 56 kDa tham chiếu chủng KARP nhận thấy trình tự tƣơng đồng 99% với trình tự chủng KARP mã HQ718459.1 trên genbank. Bởi vậy, chúng tơi sử dụng dịng HT09.2 cho các nghiên cứu tiếp theo. So sánh tƣơng tự, chúng tôi lựa chọn đƣợc: chủng HT11 chứa plasmid mang vector pLATE tái tổ hợp số 2 (kí hiệu HT11.2); chủng HT49 chứa plasmid mang vector tái tổ hợp số 4 (kí hiệu HT49.4). Chủng YB50 chứa plasmid mang vector tái tổ hợp số 7 (kí hiệu YB50.2) đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Sau khi kiểm tra chính xác trình tự gen ht-09, ht-11, ht-49 và yb-50, plasmid tái tổ hợp pLATE_HT09, HT11, HT49 và YB50 đƣợc biến nạp vào tế bào biểu hiện
E. coli Rosetta 1 để tiến hành biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa trong vi
khuẩn E. coli Rosetta 1.
Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa trong vi khuẩn E. coli Rosseta 1 3.1.3.
Trong quá trình thiết kế, cả 4 gen ht-09, ht-11, ht-49 và yb-50 đƣợc thiết kế gắn thêm 6 bộ ba mã hóa cho histidine ở đầu C, vì vậy, protein đƣợc biểu hiện sẽ gắn thêm 6 gốc histidine thuận lợi cho quá trình tinh sạch bằng sắc ký ái lực sau này. Theo t nh tốn, đoạn gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên cho ht-09, ht- 11, ht-49 và yb-50 có k ch thƣớc lần lƣợt khoảng 1149 bp, 1113 bp, 1146 bp và 1200 bp. Protein HT-09, HT-11, HT-49 và YB-50 sau tổng hợp có trọng lƣợng phân tử lần lƣợt là 46 kDa, 44 kDa, 46 kDa và 48 kDa. Kết quả trên hình 12 cho thấy, sau khi cảm ứng với IPTG, cả 4 dòng tế bào E. coli Rosetta 1 mang plasmid tái tổ hợp đều xuất hiện một vạch băng đậm có k ch thƣớc theo đúng nhƣ tính tốn. Các vạch băng này khơng đƣợc quan sát ở tế bào E. coli Rosetta 1 và tế bào E. coli Rosetta 1 mang vector pLATE51. Nhƣ vậy, cả 4 kháng nguyên HT-09, HT-11, HT-49 và YB-50 tái tổ hợp đã đƣợc biểu hiện thành công trong tế bào E. coli Rosetta 1.
Hình 12: Kết quả kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp HT-09, HT-11,
HT-49 và YB-50 trong tế bào E. coli Rosetta 1. Đƣờng chạy 1. Tế bào E. coli
Rosetta 1, đƣờng chạy 2. Tế bào E. coli Rosetta 1 mang vector pLATE51, đƣờng
chạy 3-6. Tế bào E. coli Rosetta 1 mang plasmid tái tổ hợp pLATE_HT09,
pLATE_HT11, pLATE_HT49 và pLATE_YB50 cảm ứng với 0,5 mM IPTG ở 37oC trong 4 giờ, M. Thang chuẩn protein (Thermo Scientific)
3.1.4. Kiểm tra mức độ phản ứng của protein tái tổ hợp với mẫu huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật Western blot
Protein tái tổ hợp đƣợc sử dụng làm nguyên liệu chế tạo bộ kit dùng trong chẩn đốn bệnh sốt mị dựa trên nguyên lý bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Bởi vậy, để kiểm tra chính xác sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, cả 4 kháng nguyên HT-09, HT-11, HT-49 và YB-50 đã đƣợc tiến hành phản ứng lai miễn dịch bằng Western blot sử dụng huyết thanh của bệnh nhân chẩn đốn sốt mị dƣơng t nh với O. tsutsugamushi chủng Karp, Gilliam, TA763 và Kato làm kháng thể 1 (kháng thể pha lỗng 5000 lần). Vì kháng ngun 56 kDa có tƣơng tác miễn dịch với kháng thể IgM trong bệnh nhân nên chúng tôi sẽ sử dụng IgM để kiểm tra t nh đặc hiệu của phản ứng.
Kết quả western blot chỉ ra, protein tái tổ hợp từ 4 dòng đều liên kết với kháng thể IgM và cho một băng có k ch thƣớc khoảng 50 kDa tƣơng ứng với kích
thƣớc của protein tái tổ hợp, chứng tỏ protein có t nh đặc hiệu tốt (hình 13). Ngồi ra, protein tái tổ hợp HT49 xuất một băng phụ thấp hơn thấp hơn băng protein tái tổ hợp HT49 (46 kDa). Nguyên nhân là do protein tái tổ hợp 56 kDa có đi pelB có độ dài 22 axit amin giúp định hƣớng protein ngoại lai tiết ra khoang chu chất. Sau khi protein đi qua màng thì peptit t n hiệu này bị cắt bởi một protease xác định làm cho trọng lƣợng phân tử protein nhỏ đi. Ngoài ra, khi kiểm tra chéo huyết thanh và kháng nguyên của 4 dòng Karp, Gilliam, Kato và TA763, kiểm tra bằng Western blot thấy băng protein kháng nguyên 56 kDa vẫn lên. Có thể giải th ch đƣợc, giữa các chủng O. tsutsugamushi có sự phát sinh từ một loài gần nhau nên protein kháng nguyên 56 kDa vẫn còn nhiều các epitop trong kháng nguyên giống nhau.
Hình 13: Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp bằng Western
blot. M: thang chuẩn protein, (-) Tế bào E. coli Rosetta 1 không mang plasmid tái tổ hợp, HT09: Tế bào E. coli Rosetta 1 mang plasmid tái tổ hợp pLATE_HT09, HT11: Tế bào E. coli Rosetta 1 mang plasmid tái tổ hợp pLATE_HT11, HT-49: Tế bào E.
coli Rosetta 1 mang plasmid tái tổ hợp pLATE_HT49, YB-50: Tế bào E. coli
Rosetta 1 mang plasmid tái tổ hợp pLATE_YB50.
Bên cạnh đó, protein HT-09, HT-11, HT-49 và YB-50 đƣợc thiết kế biểu hiện có gắn gốc histidine vì vậy nghiên cứu đã tiến hành kiểm chứng một lần nữa sự biểu hiện của protein HT-09, HT-11, HT-49 và YB-50 bằng phƣơng pháp Western
blot sử dụng kháng thể kháng Histag (Thermo Scientific). Kết quả cho thấy trên màng lai PVDF xuất hiện vạch băng đúng k ch thƣớc tƣơng tự kết quả trên.
3.2. Lựa chọn một số điều kiện biểu hiện kháng nguyên 56 kDa Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng
3.2.1.
Nhiệt độ nuôi cấy là một trong các yếu tố có ảnh hƣởng lớn đến sự phát triển và sinh tổng hợp protein của vi sinh vật. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng của E. coli là 37oC. Tuy nhiên, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trƣởng của vi sinh vật chƣa hẳn là nhiệt độ tốt cho sinh tổng hợp protein quan tâm. Nếu nhiệt độ quá cao, tính ổn định của tế bào giảm dần, các plasmid dễ bị đào thải hơn, các mRNA dễ bị phá hủy và protein quan tâm có thể mất hoạt tính do cấu trúc gấp nếp không đúng. Ở nhiệt độ cao, protein thƣờng tồn tại ở dạng không tan do q trình đóng gói protein khơng đáp ứng đƣợc lƣợng protein quan tâm sản xuất ra, vì vậy thƣờng khơng đảm bảo hoạt tính sinh học. Ngƣợc lại, khi nhiệt độ ni cấy quá thấp, khả năng tăng trƣởng và sản xuất protein cũng giảm theo. Vì vậy, khảo sát nhiệt độ ni cấy trong q trình biểu hiện protein đóng vai trị quan trọng trong việc nâng cao hiệu suất biểu hiện protein đ ch.