Kết quả điện di hình 14 cho thấy hàm lƣợng protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện tốt nhất ở 30°C và 37oC và giảm mạnh ở 25°C. Hàm lƣợng protein tái tổ hợp 56 kDa đối với chủng HT09, YB50 thu đƣợc nhiều nhất ở 37°C tƣơng đồng với các nghiên cứu trƣớc [10, 33]. Tuy nhiên, hàm lƣợng protein tái tổ hợp 56 kDa của các chủng HT11, HT49 thu đƣợc nhiều nhất ở 30°C, có thể ở nhiệt độ càng cao (37°C) khả năng đào thải plasmid diễn ra. Vì vậy, nhiệt đội tối ƣu cho biểu hiện protein tái tổ hợp 56 kDa là 37°C (chủng HT09, YB50) và 30°C (chủng HT11, HT49).
Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG đến quá trình tổng hợp kháng nguyên 56 kDa 3.2.2.
Gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa sau khi gắn vào vector đƣợc điều khiển tổng hợp bởi promoter T7 trên vector pLATE. Promoter này đƣợc cảm ứng bởi sự có mặt của IPTG trong mơi trƣờng ni cấy. Nồng độ IPTG cao có thể gây độc cho tế bào, ức chế vi khuẩn sinh trƣởng. Ngƣợc lại, nồng độ IPTG quá thấp làm giảm tốc độ phiên mã, ảnh hƣởng đến năng suất tổng hợp protein. Hơn nữa, IPTG là một cơ chất đắt tiền với điều kiện th nghiệm tại Việt Nam. Bởi vậy, việc xác định đƣợc nồng độ IPTG phù hợp cho sinh tổng hợp protein đóng vai trị quan trọng và có ý nghĩ thực tiễn trong sản xuất. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của IPTG lên khả năng sinh trƣởng của chủng tái tổ hợp cho thấy nồng độ của IPTG có ảnh hƣởng tới khả năng tăng trƣởng của chủng mang gen t09 t11 t49 v y 50. Mật độ tế bào của 4 chủng vi khuẩn giảm tỷ lệ nghịch với sự tăng nồng độ của chất cảm ứng IPTG (hình 15).
Hình 15: Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng sinh trƣởng của E. coli tái tổ
Chúng tôi khảo sát dải nồng độ IPTG từ 0-1 mM và nhận thấy, khi khơng có chất cảm ứng IPTG tốc độ sinh trƣởng của E. o Rosetta 1 tăng lên và không quan sát thấy protein tái tổ hợp 56kDa trên gel SDS-PAGE. Khi cảm ứng với IPTG ở các nồng độ từ 0,25 mM đến 1 mM cho thấy protein 56 kDa đƣợc tổng hợp tăng tỷ lệ với sự tăng của nồng độ IPTG. Tuy nhiên, sự khác nhau về hàm lƣợng protein 56 kDa tổng hợp giữa các nồng độ IPTG (0,25-1 mM) là không nhiều. Ảnh điện di đã cho thấy sự chênh lệch về mức độ biểu hiện ở nồng độ IPTG khác nhau. Sự chênh lệch này thể hiện qua cƣờng độ sáng của băng protein tái tổ hợp so với protein ở đối chứng âm có cùng k ch thƣớc.
Hình 16: Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tổng hợp kháng nguyên 56
kDa tái tổ hợp trong tế bào E. o mang HT09, HT11, HT49 và YB50. M: thang
Nhƣ vậy, căn cứ vào mật độ tế bào thu mẫu và độ đậm của băng protein HT-09 và HT-11 biểu hiện tốt ở nồng độ 0,1mM, chúng tôi quyết định lựa chọn nồng độ cảm ứng 0,1 mM IPTG để cảm ứng biểu hiện cho mẫu HT09 và HT11. Tƣơng tự, protein YB50 đƣợc biểu hiện tốt ở 0,5 mM IPTG và HT-49 biểu hiện tốt ở 0,25 mM IPTG. Vì vậy, hai nồng độ IPTG này đƣợc lựa chọn cho cảm ứng sinh tổng hợp HT-49 và YB-50.
Ảnh hƣởng của thời gian thu mẫu đến sinh tổng hợp kháng nguyên 56 kDa 3.2.3.
Sau khi đƣợc bổ sung IPTG vào môi trƣờng, protein tái tổ hợp sẽ đƣợc tăng cƣờng tổng hợp. Do tế bào chỉ sinh trƣởng đến một sinh khối nhất định nên lƣợng protein tái tổ hợp cũng chỉ đạt tối đa ở một thời điểm nhất định. Khi tế bào đạt đến pha cân bằng lúc này nguồn dinh dƣỡng bị cạn dần nên tế bào có khuynh hƣớng tiết nhiều protease để phân hủy và chuyển hóa tế bào chết thành các sản phẩm phụ thành dinh dƣỡng để duy trì sự sống cho tế bào. Vì vậy, đối với nhiều loại protein tái tổ hợp nhạy cảm với protease, nếu khơng đƣợc thu ở thời điểm thích hợp thì hàm lƣợng protein mong muốn sẽ giảm đáng kể.
Trong thí nghiệm này, các chủng tái tổ hợp đƣợc nuôi cấy ở 37oC và cảm ứng ở nồng độ IPTG phù hợp, tế bào sau cảm ứng đƣợc thu ở các thời điểm từ 0, 1, 2, 3, 4 giờ và qua đêm. Kết quả cho thấy, khi tăng thời gian thu mẫu từ 0 đến 3 giờ sau cảm ứng hàm lƣợng cả 4 protein tái tổ hợp đều tăng lên. Tuy nhiên, khi tăng thời gian thu mẫu lên 4 giờ hoặc qua đêm đã không làm tăng hàm lƣợng protein tái tổ hợp so với thời gian thu mẫu là 3 giờ (hình 17). Do vậy, thời gian thu mẫu là 3 giờ sau cảm ứng đã đƣợc lựa chọn cho quá trình sinh tổng hợp kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp.
Hình 17: Ảnh hƣởng của thời gian thu mẫu đến sinh tổng hợp kháng nguyên 56 kDa.
M: marker, 0-4: thời gian thu mẫu (giờ); QĐ: thời gian thu mẫu qua đêm.
3.3. Tinh sạch kháng nguyên 56 kDa X lý tiền tinh chế
3.3.1.
Tính tan của protein đóng vai trị quan trọng quyết định đến hoạt tính sinh học của protein. Vì vậy, sau khi kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, tính tan (soluble form) và khơng tan (insoluble form) của protein đã đƣợc kiểm tra. Sử dụng phƣơng pháp siêu âm phá tế bào, dƣới tác dụng mạnh của sóng siêu âm kết hợp với sốc nhiệt đã phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng protein. Sau khi li tâm, phần protein tan tồn tại ở dạng dịch nổi (pha tan), các thành phần của tế bào và
protein không tan đƣợc lắng xuống ở dạng tủa (pha không tan). Pha tan và không tan đƣợc thu lại và kiểm tra bằng điện di protein trên gel polyacrylamide 12,6%.
Kết quả khảo sát ban đầu cho thấy cả 4 kháng nguyên tái tổ hợp 56 kDa đều biểu hiện ở dạng không tan. Để làm tăng t nh tan của protein này, các điều kiện biểu hiện đã đƣợc khảo sát, tuy nhiên, kết quả cho thấy cả 4 kháng nguyên HT-09, HT-11, HT-49 và YB-50 đều biểu hiện ở dạng khơng tan (đƣờng chạy P1, hình18). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đó (10). Để thuận lợi cho q trình tinh chế, mẫu protein dạng không tan đã đƣợc làm tan trong các nồng độ ure khác nhau từ 0, 2, 4, 6 và 8 M. Kết quả cho thấy kháng nguyên HT-11 và YB-50 tan tốt ở nồng độ 6 M ure (hình 18 B, D, đƣờng chạy S4) và kém tan ở nồng độ 8 M ure (phụ lục), trong khi HT-09 và HT-49 tan tƣơng đối tốt ở nồng độ 6 M ure (hình 18 A, C, đƣờng chạy S4) và tan gần nhƣ hoàn toàn ở nồng độ 8 M ure (phụ lục). Sau quá trình xử lý protein trong các nồng độ ure từ thấp đến cao, kết quả cho thấy protein đ ch tan chủ yếu trong nồng độ 6 M ure (hình 18), các protein tạp đã đƣợc loại bỏ hiệu quả qua các bƣớc làm tan và tủa, kết quả này phù hợp với các công bố trƣớc đây. Các nghiên cứu của Cao và cộng sự năm 2007, Ching và cộng sự năm 1998 cho thấy kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp tan tốt ở nồng độ 6 M ure [10] tuy nhiên một số nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng nồng độ 8 M ure là nồng độ phù hợp để làm tan protein tái tổ hợp 56 kDa [14].
Căn cứ vào kết quả trên hình 18 và để giảm chi phí cho q trình xử lý tiền tinh chế và thuận lợi cho quá trình loại ure sau tinh sạch, nồng độ 6 M ure đã đƣợc lựa chọn để hòa tan 4 kháng nguyên tái tổ hợp HT-09, HT-11, HT-49 và YB-50. Dịch protein hòa tan trong 6 M ure đƣợc thu lại và đƣa lên cột sắc ký ái lực Hitrap HP chelating 5 ml để tiến hành tinh sạch protein.