STT Tên dung dịch Thành phần
1 Ampicilin 100mg/ml 1 g ampicilin; 10 ml H2O; lọc vô
trùng bằng màng lọc 0,45µm
2 IPTG 1M 2,38 g IPTG; 8 ml H2O; lọc vơ
trùng bằng màng lọc 0,45µm
3 CaCl2 100 mM 1,11 g CaCl2; 100 ml H2O; khử trùng 121ºC trong 20 phút
Máy óc và thiết bị 2.1.3.
Box cấy vô trùng (Sanyo); máy ly tâm lớn (Beckman); máy ly tâm để bàn (Eppendorf); cân phân t ch (Sartorius); máy điện di ADN (Bio-rad); máy UV (Bio-rad), bể ổn nhiệt (DAI HAN), máy đo quang phổ (BioSpec-mini), máy lắc ổn nhiệt (Biosan), máy nhân bản gen (Eppendorf), máy siêu âm (Misonix), nguồn và bể điện di protein (Cleaver), nguồn và bể chạy western blot (Clearver), tủ ấm (Memmert).
Vật tƣ tiêu hao 2.1.4.
Ống Eppendorf các loại 1,5 ml, 2 ml, ống giữ giống các loại (Eppendorf), đầu côn nhựa loại 1 ml, đầu côn nhựa loại 200 ul, đầu côn nhựa loại 10 ul, đĩa petri (SPL Life Sciences), màng lọc vô trùng, que cấy thủy tinh, kim tiêm vơ trùng, bình tam giác các loại, chai thủy tinh, ống falcon 15 ml, ống falcon 50 ml (SPL Life Sciences).
Dụng cụ, phụ tùng, vật tƣ đạt tiêu chuẩn sử dụng cho nghiên cứu sinh học phân tử: găng tay cao su, giấy parafilm, giấy bạc, túi nilon, đồ bảo hộ lao động: áo blu, khẩu trang, k nh bảo hộ (Việt Nam).
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Nhân gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa bằng phƣơng pháp PCR 2.2.1.
DNA tổng số đƣợc sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu: mồi xuôi P51KARPF (5'–GGT GAT GAT GAT GAC AAG ATG ACA ATT GCT CAA GGT TTT AGA-3’) và mồi ngƣợc (P51KARPR: 5'-GGA GAT GGG AAG TCA TTA AAC ACC AGC ATA TAT TGA GAA TGA -3').
Phản ứng PCR gồm các thành phần theo bảng 7 bổ sung thêm 5 µg ADN tổng số. Trong đó, các mẫu ADN tổng số đƣợc pha về nồng độ ADN trong khoảng từ 40-50 ng/µl. Q trình thao tác thực hiện trong điều kiện sạch, sau đó nhanh chóng đặt mẫu vào trong máy gia nhiệt PCR. Chu trình nhiệt của phản ứng đƣợc tối ƣu nhƣ sau:
Hình 8: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Thành phần phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 7: