Thành phần phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 7:
Bảng 7: Thành phần của phản ứng PCR đoạn gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa Thành phần Thể tích (µl) Thành phần Thể tích (µl)
Phussion master mix 2x 10
Nước 4
P51KARPF 10 µM 0,5
P51KARPR 10 µM 0,5
ADN tổng số 5
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. GeneJET PCR purification kit (hãng Thermo) đƣợc sử dụng để tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR (quy trình đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất).
Điện di ADN trên ge agaro e 2.2.2.
Gel agarose 1% đƣợc chuẩn bị bằng cách hòa 1g bột agarose hòa trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1X. Đun sôi dung dịch agarose cho tới khi tan hết và để nguội đến 50oC thì đổ vào khn đã đƣợc cài lƣợc sẵn. Để gel đơng và ổn định hồn tồn trong 30 phút và rút lƣợc ra khỏi khuôn, đặt gel vào bể điện di và đổ đệm TAE 1X ngập mặt gel.
Mẫu đƣợc trộn với đệm lót mẫu. Sau đó đƣa hỗn hợp ADN vào các giếng, chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100V, khoảng 30 phút.
Sau khi điện di, gel agarose đƣợc nhuộm với dung dịch EtBr trong 10 phút và rửa bằng nƣớc cất. Các băng ADN sau khi nhuộm EtBr đƣợc quan sát dƣới đèn UV.
Tạo dòng tế bào biểu hiện ang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa 2.2.3.
Phƣơng pháp ligate và biến nạp
Sản phẩm ADN tinh sạch của gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa đƣợc đƣa vào vector pLATE thông qua bộ kit “aLICator LIC Cloning and Expression Kit 2” của hãng Thermo. Phản ứng ligate gồm các thành phần nhƣ sau:
Bảng 8: Thành phần phản ứng tạo plasmid tái tổ hợp
Thành phần Thể tích
5X LIC Buffer 2 µL
Sản phẩm PCR tinh sạch 2 µL (0,1 pmol)
H2O 5 µL
T4 ADN Polymerase, 1u/µL 1 µL Tổng thể tích phản ứng 10 µL
Tiếp theo, vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến DH5α và nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc LB-ampicilin. Sau đó, lựa chọn những khuẩn lạc mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa bằng phƣơng pháp PCR sử dụng cặp mồi LIC của bộ kit “aLICator LIC Cloning and Expression Kit 2” và giải trình tự bằng phƣơng pháp Sanger nhằm khẳng định kết quả biến nạp.
Những khuẩn lạc mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa đƣợc tinh sạch plasmid (Genejet plasmid purification kit) và biến nạp vào dòng tế bào biểu hiện
E. coli Rosseta 1 trên mơi trƣờng chọn lọc LB-ampicilin. Sau đó, kiểm tra khuẩn lạc
mang gen mã hóa kháng nguyên 56 kDa bằng phƣơng pháp PCR sử dụng cặp mồi LIC trong bộ kit “aLICator LIC Cloning and Expression Kit 2”. .
Biểu hiện kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp trong tế bào E. coli Rosseta 1 2.2.4.
Tiến hành nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli Rosetta 1 mang plasmid tái tổ hợp
ở 37oC qua đêm. Mật độ tế bào đƣợc đo ở OD600 và chuyển giống sang bình tam giác chứa 10 ml LBA (hòa về OD600 là 0,05), ni lắc 200 vịng/phút, ở 37°C khoảng 2 giờ đến khi OD600 đạt khoảng 0,4 – 0,6, lấy mẫu ra tiến hành cảm ứng với IPTG (0-1 mM). Tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ (25°
C-37°C), 200 vòng/phút. Tiến hành thu mẫu (1-4 giờ- qua đêm) và kiểm tra mật độ tế bào ở bƣớc sóng 600 nm. Tế bào đƣợc thu lại bằng cách ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, tủa đƣợc hòa trong đệm Tris-HCl 20 mM pH 8 để đạt giá trị OD600 = 10 và bảo quản dịch tế bào ở tủ -80°C. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự biểu hiện kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp đƣợc trình bày ở bảng 9:
Bảng 9: Bảng thơng số khảo sát riêng lẻ các yếu tổ ảnh hƣởng đến sự biểu hiện
kháng nguyên 56 kDa tái tổ hợp
STT Nhiệt độ cả ứng (oC)
Thời gian thu ẫu (giờ) Nồng độ IPTG (mM) 1 25 4 0,5 2 30 3 37 4 37 1 0,5 5 2 6 3 7 4 8 Qua đêm 9 37 4 0 10 0,1 11 0,25 12 0,5 13 0,75 14 1
Điện di SDS – PAGE 2.2.5.
Hút 60 l mẫu tế bào hòa trong Tris HCl 20 mM pH 8 vào các ống eppendorf 1,5 ml. Sau đó, bổ sung 20 l đệm xử lý mẫu - sample buffer 4X. Tiến hành biến t nh
protein ở 100°C trong 10 phút và đặt mẫu trên đá khoảng 2 phút. Thành phần chuẩn bị gel đƣợc trình bày ở bảng 10:
Bảng 10: Thành phần gel cô, gel tách trong điện di SDS-PAGE Hóa chất Gel tách (12,6%) Gel cơ (5%) Hóa chất Gel tách (12,6%) Gel cô (5%)
H2O 1,1 ml 1,3 ml Tris – HCl 2,25 ml (pH = 8,8) 0,5 ml (pH = 6,8) Glycerol 50% 1,8 ml 0 ml Acrylamide 30% 3,15 ml 0,35 ml SDS 10% 90 l 10 l APS 10% 60 l 20 l TEMED 6 l 2 l
Dùng pipet tra mẫu và thang chuẩn protein vào các giếng. Chế độ chạy điện di: 24 mA trong 10 phút, sau đó 48 mA trong 50 – 70 phút (đối với 2 bản gel). Khi kết thúc quá trình điện di, gel đƣợc ngâm trong dung dịch destaining 1 trong 10 phút. Sau đó nhuộm trong dung dịch coomassie blue trong 30 phút. Cuối cùng, gel đƣợc rửa với dung dịch tẩy rửa – destaining 2 cho đến khi quan sát rõ đƣợc các băng protein.
Thẩ tách iễn dịch Western blot 2.2.6.
Protein tổng số sau điện di trên gel polyacrylamide 12,6% đƣợc chuyển lên màng PVDF sử dụng thiết bị chuyển màng (Cleaver Scientific) trong 1 giờ. Màng sau đó đƣợc ủ trong dung dịch sữa skim milk 5% pha trong dung dịch TBS (0,5 M Tris HCl, pH 7,5; 2,5 M NaCl) 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành rửa màng bằng dung dịch TTBS (TBS bổ sung 0,05% Tween-20) và TBS 3 lần, mỗi lần 5 phút. Màng sau đó đƣợc ủ với huyết thanh bệnh nhân dƣơng t nh với O. tsutsugamushi
pha loãng 2000-5000 lần trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa màng lần lƣợt bằng dung dịch TTBS và TBS, tiếp theo màng đƣợc ủ với kháng thể 2 là kháng thể kháng IgM ngƣời cộng hợp HRP pha loãng 10000 lần trong 1 giờ ở nhiệt độ phịng. Màng sau đó đƣợc rửa bằng dung dịch TBS và TTBS. Cuối cùng màng đƣợc hiện màu bằng dung dịch hiện màu TMB (Thermo Scientific).
Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực 2.2.7.
2.2.7.1. Tiền tinh chế x lý protein tái tổ hợp
Dịch tế bào R1_pLATE_56kDa (OD600=10) đƣợc siêu âm phá tế bào trên đá trong 30 phút. Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, dịch nổi (dung dịch S1). Tủa đƣợc hòa lại trong đệm A (20 mM Tris-HCl, pH 8; 0,5 mM EDTA; 1% Triton- X100) (dung dịch P1). Dung dịch P1 đƣợc bổ sung urea đến nồng độ cuối cùng là 2 M, lắc đều 10 phút ở nhiệt độ phòng. Li tâm 15 phút ở 8000 vòng/phút, dịch nổi (dung dịch S2). Tủa đƣợc hòa lại trong đệm A (20 mM Tris-HCl, pH8; 0,5 mM EDTA; 1% Triton-X100) (dung dịch P2). Dung dịch P2 đƣợc bổ sung urea đến nồng độ cuối cùng là 4 M, lắc đều ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Tiếp tục li tâm 15 phút ở 8000 vòng/phút, dịch nổi (dung dịch S3). Tủa đƣợc hòa lại bằng đệm A (20 mM Tris-HCl, pH 8; 0,5 mM EDTA; 1% Triton-X100) (dung dịch P3). Dung dịch P3 đƣợc bổ sung urea đến nồng độ cuối cùng là 6 M, lắc đều 10 phút ở nhiệt độ phòng. Li tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút, dịch nổi (dung dịch S4). Tủa đƣợc hòa lại trong đệm A (dung dịch P4). Các dung dịch đƣợc giữ lại và kiểm tra khả năng hòa tan của protein trong urea bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,6%.
2.2.7.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phƣơng pháp ắc ký ái lực
Bốn protein tái tổ hợp 56 kDa đƣợc tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực Ni2+ Hitrap HP chelating 5 ml (GE). Quy trình tinh sạch đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau: Bƣớc 1: Rửa cột bằng 25 ml nƣớc cất 2 lần, bƣớc 2: Rửa cột trong 25 ml dung dịch đệm A (20 mM Tris-HCl, pH 8; 1% Triton-X100; 6 M urea, 10 mM Imidazole), bƣớc 3: 20 ml dung dịch protein trong đệm A chứa 6 M urea đƣợc đƣa lên cột. Protein tái tổ hợp có gắn đi histidine có ái lực mạnh với Nickel trên cột sẽ
đƣợc giữ lại trên cột, những protein khơng có histidine và các thành phần khác sẽ đi ra khỏi cột. Bƣớc 4: Protein tái tổ hợp 56 kDa đƣợc đẩy ra khỏi cột bằng 10 ml dung dịch đệm B chứa 20mM Tris-HCl, pH8; 1% Triton-X100; 6 M urea, 100 mM Imidazole, bƣớc 5: Làm sạch cột bằng 25 ml dung dịch đệm A chứa 250 mM Imidazole, bƣớc 6: Rửa cột bằng 25 ml nƣớc cất 2 lần. Cột đƣợc giữ trong 20% ethanol và bảo quản ở 4oC. Các phân đoạn protein trƣớc và sau tinh sạch đƣợc giữ lại và kiểm tra độ sạch bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,6%.