khuẩn S .sui gây ra
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.4. Phương pháp chế tạo vắc xin phòng bệnh viêm phổi cho lợn
Lựa chọn các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae; P. multocida và
Streptococcus suis thuộc các serotype đặc trưng, mang đầy đủ các yếu tố gây
bệnh và có độc lực cao để sử dụng làm giống chế tạo thử nghiệm vắc xin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn.
* Phương pháp chế tạo thử nghiệm vắc xin nhũ dầu:
Vắc xin được chế tạo thử nghiệm theo quy trình sản xuất vắc xin vơ hoạt tồn khuẩn có bổ trợ nhũ dầu, bằng phương pháp lên men sục khí tại Nhà máy vắc xin, Cơng ty cổ phần thuốc thú y Marphavet. Quy trình tóm tắt được trình bày ở hình 2.1 (phụ lục 1).
- Kiểm tra thuần khiết của canh trùng chế tạo vắc xin
Kiểm tra thuần khiết được tiến hành song song với các bước nuôi cấy canh trùng riêng rẽ của từng chủng vi khuẩn từ giống sản xuất nhỏ đến nhỡ và lớn. Tiến hành lấy mẫu để kiểm tra thuần khiết bằng cách: phết tiêu bản, nhuộm Gram, đồng thời nuôi cấy trên các loại môi trường (nước thịt thường, nước thịt gan yếm khí, thạch máu, thạch MacConkey). Sau khi các canh trùng vi khuẩn riêng của giống sản xuất lớn được đếm số vi khuẩn và đạt tiêu chuẩn thuần khiết, các canh trùng được phối hợp với nhau theo tỷ lệ xác định.
* Kiểm tra vơ trùng, an tồn và hiệu lực của vắc xin
- Kiểm tra vô trùng của vắc xin thử nghiệm
Từ mỗi lô vắc xin, tiến hành kiểm tra vô trùng trên các loại mơi trường ni cấy vi khuẩn thích hợp như môi trường thạch thường, thạch máu, thạch TSA (có bổ trợ YE), thạch MacConkey, nước thịt thường, nước thịt TYE, nước thịt gan yếm khí, thạch nấm. Các ống môi trường, sau khi cấy được bồi dưỡng
ở tủ ấm 370C có bổ sung 5% CO2, riêng thạch nấm thì để ở nhiệt độ phịng. Mỗi ngày đọc kết quả 1 lần. Nếu sau 7 ngày khơng có bất cứ một loại vi khuẩn nào mọc trên các mơi trường thì vắc xin được coi là đạt tiêu chuẩn vơ trùng.
- Kiểm tra an tồn trên chuột bạch
Đối với mỗi lô vắc xin: dùng 15 chuột bạch khoẻ chia làm 2 lơ. Lơ thí nghiệm gồm 10 con được tiêm vắc xin vào xoang phúc mạc 5 con, đường tĩnh mạch đuôi 5 con. Lô đối chứng gồm 5 con tiêm 0,5 ml nước sinh lý vào phúc xoang. Theo dõi chuột trong 10 ngày. Vắc xin đạt chỉ tiêu an toàn khi chuột ở các lơ thí nghiệm và đối chứng đều sống khỏe mạnh, khơng con nào có biểu hiện phản ứng sau khi tiêm qua thời gian theo dõi.
- Kiểm tra hiệu lực vắc xin bằng phương pháp thay thế trên chuột bạch
Đối với mỗi lô vắc xin được tiêm cho 10 chuột bạch khỏe bằng đường tiêm dưới da, liều 0,2 ml/con và tiêm lập lại mũi 2 sau 7 ngày, liều 0,2 ml/con; 5 con chuột đối chứng không tiêm vắc xin. Sau 21 ngày tiêm vắc xin mũi thứ nhất, tiến hành thử thách cường độc với canh khuẩn của các chủng chế vắc xin với liều 10LD50 cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng. Theo dõi trong 10 ngày, lô vắc xin được đánh giá đạt hiệu lực trong phương pháp kiểm tra thay thế nếu chuột đối chứng chết hết, trong khi lơ thí nghiệm số chuột cịn sống 3/4 là đạt yêu cầu.