Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P.
3.1.1. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae
P. multocida và S. suis phân lập được; chọn chủng vi khuẩn chế tạo vắc xin thử nghiệm.
Qua 256 mẫu bệnh phẩm lợn mắc bệnh viêm phổi phân lập được từ những địa điểm khác nhau tại tỉnh Thái Nguyên trong ba năm 2017, 2018, 2019 đã xác định được 66 chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, 89 chủng P.
multocida và 101 chủng S. suis. Các chủng vi khuẩn trên đã được kiểm tra, giám định một số đặc tính, xác định serotype và được lưu giữ tại viện Thú y Quốc gia, nhà máy vắc xin Marphavet. Ba loại vi khuẩn S.suis, P.multocida
và A. Pleuropneuminiae phân lập được từ đường hô hấp của lợn có đặc tính hình thái, ni cấy, tính chất bắt mầu và các đặc tính sinh học giống như các tài lieeujkinh điển đã mô tả.
Chúng tôi chỉ lựa chọn một số chủng điển hình để tiến hành kiểm tra làm cơ sở lựa chọn các chủng chế tạo vắc xin thử. Vi khuÈn muèn g©y bệnh đ-ợc thì điều kiện tiên quyết là phải có độc lực. Để biết đ-ợc các chủng vi khuẩn phân lập đ-ợc cã ®éc lùc hay không chỳng ti tiến hành kim tra độc
lực ca các chng vi khn bằng phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm.
3.1.1. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được phân lập được
Tùy vào cấu trúc và những sản phẩm do vỏ và các độc tố tạo nên độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy những chủng A. pleuropneumoniae có kích thước lớn hơn và lớp vỏ dày hơn, bám dính hơn có độc lực cao hơn những chủng độc lực thấp.
Sau khi đã xác định hình thái, ni cấy, đặc tính sinh vật, hóa học, serotype thì việc kiểm tra độc lực trên động vật thí nghiệm là cần thiết nhằm làm rõ vai trị gây bệnh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được và làm cơ sở lựa chọn các chủng vi khuẩn để chế tạo vắc xin thử nghiệm. Chúng tôi đã chọn 6 chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae có đặc tính hình thái, ni cấy, đặc tính sinh vật, hố học điển hình và đại diện cho ba serotype 2, 5a và 5b để xác định độc lực của chúng trên chuột bạch. Mỗi chủng A.
pleuropneumoniae được tiêm vào phúc xoang cho 2 chuột thí nghiệm, sử dụng
canh trùng đã nuôi cấy 24 giờ ở 37oC trong điều kiện có 5 - 10% CO2, liều tiêm 0,5 ml/con; số chuột thí nghiệm được theo dõi trong vòng 7 ngày. Kết quả kiểm tra độc lực được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn
A. pleuropneumoniae phân lập được
STT Ký hiệu chủng Số chuột tiêm (con) Liều tiêm phúc xoang (ml/con)
Kết quả theo dõi chuột thí nghiệm chết sau khi tiêm
(con) 12h 18h 24h 30h 36h 48h 168h Cộng 1 APP-TN 1 2 0,5 1 1 0 2 2 APP-TN 2 2 0,5 1 1 0 2 3 APP-TN 3 2 0,5 1 1 0 2 4 APP-TN 4 2 0,5 1 1 0 2 5 APP-TN 5 2 0,5 1 0 1 6 APP-TN 6 2 0,5 1 0 1
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy: Trong 6 chủng A. pleuropneumoniae kiểm tra độc lực có 4 chủng có độc lực mạnh, giết chết 100% chuột thí nghiệm trong khoảng thời gian từ 12- 30 giờ là APP-TN1; APP-TN2; APP-TN3 và
APP-TN4; 2 chủng giết chết 50% chuột thí nghiệm trong khoảng thời gian từ 36 - 48 giờ là APP-TN5 và APP-TN6. Tất cả số chuột sau khi chết được mổ khám kiểm tra bệnh tích đều thấy phổi sưng xuất huyết phù nề, viêm dính giai đoạn đầu và phân lập lại được vi khuẩn A. pleuropneumoniae thuần khiết từ máu tim. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với với kết quả của một số tác giả như Cù Hữu Phú và cs (2007) kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae trên 15 chuột thí nghiệm, cho tỷ lệ chuột chết là 100%; Nguyễn Quang Tuyên và cs (2010) chọn 10 chủng A. pleuropneumoniae phân lập được ở lợn mắc bệnh viêm phổi - màng phổi kiểm
tra độc lực trên chuột thí nghiệm, cả 10 chủng đều gây chết 100% chuột thí nghiệm trong khoảng thời gian từ 18 - 48 giờ. Trong đó có 2/10 chủng gây chết chuột sau 18 giờ; 7/10 chủng gây chết chuột sau 24 giờ và 1/10 chủng gây chết chuột sau 48 giờ.
Chúng tôi xác định liều LD50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân
lập được và đã xác định được liều LD50 của A. pleuropneumoniae serotype 2 là LD50 = 4,3 x 107CFU và serotype 5 là LD50 = 4,8 x 107CFU.
Kết luận vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được có độc lực cao đối với chuột bạch, là một trong những nguyên nhân quan trọng gây viêm phổi cho lợn nuôi ở tỉnh Thái Nguyên.
3.1.2. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida
phân lập được.
Để làm rõ vai trò gây viêm phổi ở lợn của vi khuẩn P. multocida, từ tủ lưu trữ các chủng P. multocida phân lập được ở lợn tại Thái Ngun chúng tơi chọn 6 chủng có đặc tính sinh vật, hóa học điển hình được ký hiệu như sau: PAS-TN 1, PAS-TN 2, PAS-TN 3, PAS-TN 4, PAS-TN 5, PAS-TN 6 và tiến hành xác định độc lực trên chuột bạch. Mỗi chủng vi khuẩn P. multocida tiêm cho 2 chuột vào phúc xoang, với liều 0,5 ml canh trùng nuôi cấy vi khuẩn này ở 37oC/24 giờ; số chuột thí nghiệm được theo dõi trong vịng 7 ngày. Kết quả
được trình bày tại bảng 3.2. Qua bảng 3.2 cho thấy cả 6 chủng vi khuẩn P. multocida giết chết 100% chuột thí nghiệm trong vịng 12 - 48 giờ, trong đó
có 2 chủng là PAS-TN 5 và PAS-TN 2 độc lực mạnh nhất, đều giết chết chuột trong vòng 12 - 24 giờ sau khi tiêm. Kết quả thu được của chúng tôi cũng tương đồng với nghiên cứu của Đỗ Quốc Tuấn và Nguyễn Quang Tuyên (2007) khi kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập
được ở lợn thuộc ba tỉnh Thái Nguyên, Tuyên Quang và Bắc Kạn đã cho thấy các chủng vi khuẩn P. multocida đều có độc lực mạnh gây chết chuột thí nghiệm từ 50 - 100% trong thời gian từ 20 - 48 giờ; Đặng Xuân Bình và cs (2010) kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được từ trâu, bò và lợn ở 2 tỉnh Cao Bằng, Hà Giang đã cho biết các chủng vi khuẩn đều có độc lực mạnh gây chết chuột thí nghiệm từ 80 - 100% trong vòng 48 giờ sau khi công cường độc.
Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn
P. multocida phân lập được
STT Ký hiệu chủng Thuộc serotype Số chuột tiêm (con) Liều tiêm phúc xoang (ml/con)
Kết quả theo dõi chuột thí nghiệm chết sau khi tiêm (con)
12h 18h 24h 36h 48h 168h Cộng 1 PAS-TN 1 A 2 0,5 1 1 0 2 2 PAS-TN 2 D 2 0,5 1 1 0 2 3 PAS-TN 3 A 2 0,5 1 1 0 2 4 PAS-TN 4 D 2 0,5 1 1 0 2 5 PAS-TN 5 A 2 0,5 1 1 0 2 6 PAS-TN 6 D 2 0,5 1 1 0 2
Chúng tôi đã tiến hành mổ khám những con chuột chết và thấy có những bệnh tích như bao tim tích nước vàng, gan, phổi sưng, các phủ tạng xuất
huyết. Đây là bệnh tích đặc trưng, điển hình của chuột chết khi tiêm vi khuẩn P.
multocida cường độc. Tiến hành phân lập lại vi khuẩn P. multocida từ máu
tim của những chuột chết đều cho kết quả dương tính.
Chúng tơi xác định liều LD50 của vi khuẩn P. multocida phân lập được và đã xác định được liều LD50 của chủng P. multocida serotype A là LD50 = 4 x 107 CFU và serotype D là LD50 = 4,2 x 107CFU.
Như vậy, phần lớn các chủng vi khuẩn P. multocida mà chúng tơi phân lập được đều có độc lực mạnh, chúng đều có khả năng gây viêm phổi cho lợn khi gặp điều kiện thuận lợi, khi sức đề kháng của lợn giảm do thời tiết thay đổi, chăm sóc ni dưỡng kém hoặc bị mắc PRRS.