khuẩn S .sui gây ra
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.5. Phương pháp nghiên cứu đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch của
đàn lợn sau tiêm phòng vắc xin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn
do vi khuẩn A. pleuropneumoniae; P. multocida và S. suis
Dựa theo hướng dẫn và quy chế giám sát vật ni sau tiêm phịng, chúng tôi tiến hành giám sát đàn lợn sau khi tiêm vắc xin đa giá ngoài thực địa.
* Giám sát lâm sàng
Khảo sát độ an toàn của vắc xin đối với đàn lợn sau mỗi lần tiêm phịng, chúng tơi tiến hành theo dõi thơng qua điều tra trực tiếp một số đàn lợn theo dõi trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên.
* Giám sát huyết thanh
Đánh giá đáp ứng miễn dịch của đàn lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên được tiêm vắc xin đa giá tại các thời điểm sau khi tiêm: 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày và 150 ngày.
* Thu thập mẫu huyết thanh
Đối tượng lấy mẫu là huyết thanh lợn trước và sau khi tiêm vắc xin đa giá phịng bệnh viêm phổi ở lợn ni tại tỉnh Thái Nguyên.
Sát trùng bằng bông cồn ở tĩnh mạch rìa tai. Dùng bơm tiêm loại 5ml, chọc kim vào tĩnh mạch theo chiều hướng đầu kim vào phía trong cơ thể lợn, lấy 2- 3 ml máu/lợn, sau đó kéo dài pittong ra đến 5ml, bẻ gập đầu kim, đậy nắp kim lại, để nghiêng cho máu đông tự nhiên, chắt lấy huyết thanh;
Mẫu huyết thanh có thể để ở nhiệt độ 40C (Bảo quản trong hộp xốp đựng đá) trong vòng 48h, nếu bảo quản lâu hơn giữ ở nhiệt độ -200C;
Mẫu huyết thanh được vận chuyển tới Bộ môn Vi trùng thuộc Viện Thú y Quốc gia trong điều kiện lạnh (phích đá) càng sớm càng tốt, có phiếu gửi bệnh phẩm kèm theo.
* Kiểm tra hiệu giá kháng thể ở lợn sau tiêm vắc xin
- Chọn 25 lợn 6 tuần tuổi khỏe mạnh, chưa được tiêm phòng bất kỳ loại vắc xin nào có thành phần vi khuẩn giống với vi khuẩn A. pleuropneumoniae;
P. multocida và Streptococcus suis. Bằng phương pháp kiểm tra hiệu giá
kháng thể có trong máu lợn trước khi tiêm vắc xin, lợn có hiệu giá kháng thể âm tính hoặc 1/2 mới sử dụng làm lợn thí nghiệm.
Thí nghiệm được bố trí như sau:
+ Lơ thí nghiệm: Gồm 20 lợn, được tiêm 2 mũi vắc xin đa giá phòng bệnh viêm phổi với liều 2 ml/con/liều, mũi 2 cách mũi 1 một tuần.
+ Lô đối chứng: Gồm 5 lợn không được tiêm vắc xin đa giá.
- Các lợn thí nghiệm được ni chung trong cùng một ô chuồng và được xác định trọng lượng trung bình trước và sau khi tiêm vắc xin thử
nghiệm. Tiến hành theo dõi trạng thái, biểu hiện lâm sàng của các lợn trước và sau khi tiêm vắc xin.
- Tiến hành lấy mẫu máu vào các thời điểm: trước khi tiêm vắc xin và sau khi tiêm vắc xin mũi thứ nhất được 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng, 4 tháng và 5 tháng. Xác định hiệu giá kháng thể của lợn thí nghiệm bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (Indirect Haemaglunation test - IHA). Theo quy trình thường qui của Bộ mơn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia. Vắc xin có hiệu lực phòng bệnh khi hiệu giá kháng thể ngưng kết phải đạt ≥ 1/16 sau 3 tháng lợn được tiêm vắc xin.
2.4.6. Phương pháp tính LD50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis trên chuột
Cách tiến hành: canh trùng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis pha loãng hệ số 10, mỗi nồng độ tiêm cho 5 chuột với liều 0,2ml canh trùng/con, tính số chuột sống và số chuột chết theo phương pháp cộng dồn.
Cơng thức tính LD50 theo Reed & Muench (1938):
Trong đó, A là nồng độ pha loãng gây chết sát trên 50% chuột. a là tỷ lệ chuột chết do liều A gây ra (%).
b là tỷ lệ chuột chết do liều B gây ra (%) (cộng dồn) với B là nồng độ pha loãng gây chết sát dưới 50% chuột.
d là lg của nồng độ pha loãng.
2.4.7. Phương pháp xác định độc lực trên động vật thí nghiệm
Xác định độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và
S. suis phân lập được trên động vật thí nghiệm theo phương pháp thường qui
của bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia (Cù Hữu Phú, 2011).
Canh trùng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis được chuẩn bị bằng cách nuôi các vi khuẩn này vào môi trường TYE, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ (5% CO2). d b a a LgA LgLD × − − + = 50 50
Canh trùng ni cấy mỗi chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và
S. suis được tiêm cho 2 chuột bạch, mỗi chuột thí nghiệm được tiêm 0,5 ml canh trùng vào xoang phúc mạc.
Theo dõi số chuột sống và chết trong thời gian 7 ngày.
Khi chuột chết tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy máu tim, nuôi cấy và phân lập lại vi khuẩn.
2.4.8. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể ở lợn đã được tiêm vắc xin bằng phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu (Indirect Haemaglunation test- IHA)
* Các bước tiến hành phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu - IHA
- Chuẩn bị kháng nguyên
Các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae hoặc P. multocida và S. suis
chuẩn được cấy vào thạch máu và bồi dưỡng ở 37oC trong 18 giờ. Rửa mặt thạch bằng nước sinh lý, đem ly tâm huyễn dịch vi khuẩn 8000 vòng/phút, trong 15 phút, chất cặn ở đáy ống được giữ lại hoặc pha loãng với nước sinh lý sẽ thu được huyễn dịch kháng nguyên. Huyễn dịch kháng nguyên thu được đun ở 80oC/120 phút và ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút. Chắt lấy nước trong, đây chính là kháng nguyên dùng cho phản ứng ngưng kết IHA.
- Chuẩn bị hồng cầu
Cấy máu cừu vào bình có chứa dung dịch Alsever (dùng chống đông máu) theo tỷ lệ 1:1. Sau đó rửa hồng cầu bằng dung dịch PBS ba lần rồi pha thành dung dịch hồng câu 10% trong PBS.
Formalin hóa hồng cầu bằng cách: cho dung dịch hồng cầu 10% vào bình tam giác, rồi cho vào túi cellophane có chứa formalin và PBS vào bình. Tùy lượng hồng cầu mà tính lượng formalin thích hợp (tỷ lệ hồng cầu 10%: formalin: dung dịch PBS là 10: 1: 2), đưa lên máy lắc trong khoảng 20 - 22 giờ, sau đó ly tâm rửa sạch hồng cầu bẩy lần bằng dung dịch PBS rồi pha thành dung dịch treo 50% và được bảo quản trong tủ lạnh.
- Hấp thụ hồng cầu - kháng nguyên
Lấy 0,4ml hồng cầu 50% đã chuẩn bị cho vào 5 - 7ml kháng nguyên để 37oC trong 2 giờ. Hồng cầu hấp thụ kháng nguyên được rửa 3 lần bằng cách ly tâm với dung dịch PBS có thêm 0,3ml Formol, bảo quản 4 - 100C. Khi dùng hồng cầu làm phản ứng thì pha bằng dung dịch PBS để có nồng độ 1%.
- Huyết thanh cần xác định hiệu giá kháng thể được lấy từ máu lợn đã được tiêm Autovắc xin chế tạo từ các chủng A. pleuropneumoniae, P.
multocida và S. suis phân lập được và lợn thí nghiệm đối chứng. Mỗi mẫu huyết thanh được chia thành các tỷ lệ: 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64.
Tiến hành phảm ứng: phản ứng tiến hành trên tấm nhựa 96 lỗ đáy tròn. - Đánh giá kết quả: đọc kết quả lần đầu sau 4 giờ và lần 2 sau 24 giờ. + Phản ứng dương tính: hồng cầu ngưng kết thành lớp mỏng đều dưới đáy ống.
+ Phản ứng âm tính: hồng cầu lắng xuống đáy ống thành cục tròn.