2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.5. Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC Thin layer chromatography)
chromatography)
- Nguyên liệu:
+ Bản gel silica TLC 60 F254 (Merk)
+ Dung môi: n-butanol : axit axetic : H2O theo tỷ lệ 2:1:1 + Dung dịch phát hiện phản ứng:
Dung dịch 1: Hòa tan 1g diphenylamine trong 20 ml axeton và cho thêm axeton cho đủ 25 ml
Dung dịch 2: thêm 1 ml aniline vào 24 ml axeton và khuấy đều.
Dung dịch 3: 5 ml axit phosphoric 85%
Trộn đều 3 dung dịch ngay trƣớc khi sử dụng
+ Chất chuẩn: Mono-, di-, tri-, penta-, và hexamer của chitin (Sigma), hòa
tan trong nƣớc khử trùng với nồng độ 1 mg/ml. - Phƣơng pháp thực hiện:
đậy buồng này lại và để dung dịch bốc hơi bão hòa buồng chạy.
+ Chấm mẫu lên bản chạy sắc ký (cách đáy bản chạy này tối thiểu 1 cm). Lƣợng mẫu chạy có thể là 5 ml/mẫu và chấm lặp đi lặp lại nhiều lần (lƣu ý sấy khô điểm chấm mẫu sau mỗi lần chấm). Đối với chất chuẩn, thƣờng sử dụng 1-2 µl (1 µg/µl) là phù hợp.
+ Sau khi chấm mẫu, đặt bản chạy sắc ký vào buồng chạy và chạy cho đến khi mặt trên của dung môi chạy cách đỉnh của bản sắc ký 1 cm.
+ Lấy bản sắc ký ra, sấy khô và xịt dung dịch nhận biết
+ Tiếp tục sấy khô bản mỏng này và sau đó để ở 1000C trong 10 phút. Phản ứng cho kết quả là các điểm màu đỏ hoặc hồng.
+ So sánh các điểm ở mẫu và ở chất chuẩn để đọc kết quả.
2.4.6. Phƣơng pháp xác ịnh khả năng kháng vi sinh vật
+ Chuẩn bị môi trƣờng LB-agar (mục 2.3.3) cho vi khuẩn và môi trƣờng PDA (mục 2.3.1) cho các chủng nấm sinh trƣởng.
+ Hút 100 µl dịch ni mỗi loại vi sinh vật kiểm định sau đó trải lên đĩa petri + Dùng ống hút vơ trùng đƣờng kính 5 mm đục các lỗ trên đĩa thạch vừa đƣợc cấy trải vi sinh vật kiểm định.
+ Nhỏ 50 µl dung dịch cần kiểm tra tính kháng vi sinh vật lên mỗi giếng. Đối chứng dƣơng: nhỏ 50 µl nƣớc cất vào mỗi giếng.
+ Đặt đĩa thạch vào tủ 280C đối với nấm và 370C đối với vi khuẩn trong 3 ngày và đọc kết quả
+ Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định thể hiện ở các vịng sáng khơng có vi sinh vật mọc xung quanh mỗi giếng.
2.4.7. Nghi n cứu các iều kiện ni cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp chitinase c a nấm sợi
2.4.7.1. a ch n i tr ng nuôi cấy th ch h p
+ Chủng nấm sợi lựa chọn đƣợc nuôi cấy trên 6 môi trƣờng khác nhau ở 280C, lắc 220 vòng/phút. Sau 6 ngày nuôi cấy, lấy dịch nuôi cấy và ly tâm lạnh 40C,
10000 vịng/phút trong 15 phút thu dịch enzyme thơ.
+ Hoạt độ chitinase đƣợc xác định bằng phƣơng pháp định lƣợng (mục 2.4.4).
2.4.7.2. a ch n nhiệt ộ nu i cấy th ch h p
+ Chủng nấm sợi nghiên cứu đƣợc nuôi cấy bằng phƣơng pháp lên men ở mơi trƣờng thích hợp nhất (mục2.4.7.1) ở các dải nhiệt độ khác nhau: 15, 20, 25, 28, 30, 35, 40, 45, 500C. Sau 6 ngày nuôi cấy, thu dịch nuôi, ly tâm lạnh 40C, 10000 vòng/ phút trong 15 phút, xác định hoạt độ bằng phƣơng pháp định lƣợng chitinase (mục 2.4.4)
2.4.7.3. a ch n pH i tr ng th ch h p
+ Nuôi cấy chủng nấm sợi đƣợc lựa chọn trên môi trƣờng và nhiệt độ thích hợp nhất (mục 2.4.7.1 và2.4.7.2), điều chỉnh ở các pH khác nhau 3; 3,5; 4; 4,5; 5, 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9. Sau 6 ngày nuôi cấy, thu dịch nuôi, ly tâm 10000 vòng/ phút trong 15 phút ở 40C, thu dịch enzyme thô.
+ Xác định hoạt độ chitinase bằng phƣơng pháp định lƣợng (mục 2.4.4)
2.4.7.4. a ch n ngu n carbon
+ Chủng nấm sợi đƣợc lên men trên môi trƣờng tối ƣu (mục 2.4.7.1) thay các nguồn carbon khác nhau bao gồm: chitin, CMC, colloidal chitin, chitosan, N- acetyl glucosamine, sucrose, glucose, fructose, tinh bột tan nồng độ 1% ở nhiệt độ, pH thích hợp (mục2.4.7.2;2.4.7.3). Thu dịch thơ, xác định hoạt độ chitinase bằng phƣơng pháp định lƣợng (mục 2.4.4).
+ Để tối ƣu nồng độ carbon, chủng nấm sợi đƣợc nuôi trên môi trƣờng với nguồn carbon tối ƣu với các nồng độ khác nhau: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2 %. Sau 6 ngày nuôi cấy, thu dịch nuôi, ly tâm, 10000 vòng/ phút trong 15 phút ở 40C, thu dịch enzyme thô và tiến hành xác định hoạt độ bằng phƣơng pháp định lƣợng (mục 2.4.4).
2.4.7.5. a ch n ngu n nitơ
+ Chủng nấm sợi đƣợc lên men trên môi trƣờng tối ƣu (mục2.4.7.1), thay đổi các nguồn nitơ khác nhau bao gồm: peptone, cao men, cazein, (NH4)2SO4, NH4Cl, KNO3, NaNO3nồng độ 1% ở nhiệt độ, pH, nguồn cacbon thích hợp (mục2.4.7.2;
2.4.7.3và2.4.7.4). Thu dịch enzyme thô, xác định hoạt độ bằng phƣơng pháp định lƣợng chitinase (mục 2.4.4).
+ Sau khi chọn đƣợc nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase, tiến hành xác định nồng độ nitơ tối ƣu bằng cách nuôi chủng nấm sợi ở các nồng độ nitơ khác nhau: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2% trong 6 ngày, thu dịch enzyme và xác định hoạt tính bằng phƣơng pháp định lƣợng (mục 2.4.4).
2.4.7.6. a ch n th i gian nuôi cấy th ch h p
+ Chủng nấm sợi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng, nhiệt độ, pH, nguồn cacbon và nguồn nitơ thích hợp nhất (mục2.4.7.1; mục2.4.7.2; mục 2.4.7.3; mục 2.4.7.4 và2.4.7.5). Dịch enzyme thô đƣợc thu sau 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ngày nuôi cấy.
+ Xác định hoạt độ chitinase bằng phƣơng pháp định lƣợng (mục 2.4.4)
2.4.8. Tinh sạch sơ bộ enzyme chitinase
Dịch enzyme thô ↓ Ly tâm 10 phút ở 12000 vịng/phút, 40C ↓ Dịch trong ↓
Cơ đặc enzyme qua màng lọc cellulose ↓
Qua cột Ion Exchange ↓
Hình 5. Quy trình tinh sạch enzyme chitinase sinh tổng hợp bởi chủng nấm sợi lựa
chọn
Năm mƣơiml dịch enzyme sau khi ly tâm 10 phút, 12000 vòng/phút, ở40C đƣợc cho vào màng cellulose kích thƣớc 10 kDa, ly tâm lạnh 40
C, tốc độ 8000 vòng/phút cho đến khi thu đƣợc một lƣợng dịch enzyme không đổi. Dịch enzyme sau khi đƣợc cô đặc bởi màng lọc đƣa qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephacel. Cột có kích thƣớc 20 x 2,5 cm đƣợc cân bằng với đệm Tris-HCl 20mM pH 7,5. Sau đó tiến hành rửa cột với thể tích đệm Tris-HCl gấp 3 lần thể tích cột. Tiếp theo cột đƣợc tách rửa bởi muối NaCl có gradient nồng độ từ 0-1M. Tốc độ chảy là 25 ml/h. Thể tích mỗi phân đoạn thu đƣợc là 5 ml (thu 20 phân đoạn). Hàm lƣợng protein và số đơn vị hoạt tính enzyme đƣợc xác định trong mỗi phân đoạn.
2.4.9. Điện di SDS-PAGE
Khối lƣợng tƣơng đối của enzyme tách chiết và độ tinh sạch của enzyme đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide.
Chuẩn bị mẫu: 8 µl loading buffer (0,2M Tris/HCl pH 6,8 có chứa 2% SDS, 20% glycerol và 0,002% bromophenol và 5% β- mercaptoethanol) đƣợc thêm vào 16 µl enzyme trong eppendorf 1,5 ml (tỷ lệ 1:2) sau đó đun sơi 3 phút và ly tâm.
Bảng 4. Thành phần bản gel SDS-PAGE (12,5% polyacrylamid)
Thành phần Running gel (µl) Stacking gel (µl)
Acrylamid 30% 2100 220 Tris HCl 1.5M pH 8,8 1250 0 Tris HCl 1.5M pH 6,8 0 415 SDS 10% 50 16,5 Nƣớc MQ 1600 1015 APS 25 8,35
TEMED 2 0,85 Tra mẫu vào các giếng chạy điện di.
Bản điện di đƣợc chạy với cƣờng độ dòng điện 40 mA, 110V
Bản gel sau khi chạy đƣợc nhuộm với Comassine Briliant Blue (CBB) G250 0,06% (0,6 g Comassine Blue G250; 100ml CH3COOH; nƣớc vừa đủ 1000 ml) trong 30 phút rồi tiến hành rửa gel bằng dung dịch rửa (70 ml axit axetic; 50 ml methanol; nƣớc vừa đủ 1 lít) cho đến khi thấy các băng rõ ràng.
2.4.10. Xác ịnh hoạt tính chitinase trên Semi-Native PAGE
Bảng 5. Thành phần bản gel semi- native PAGE (12,5% polyacrylamide)
Thành phần Running gel (µl) Stacking gel (µl)
Acrylamide 30% 2100 220 Tris HCl 1,5M pH 8.8 1250 0 Tris HCl 1.5M pH 6.8 0 415 SDS 10% 50 16,5 Nƣớc khử ion 1100 1015 Glycochitin 0.5% 500 0 APS 10% 25 8,35 TEMED 2 0,85
- 10µl mẫu + 10µl loading buffer (0,2M Tris/HCl pH 6,8 có chứa 2% SDS, 20% glycerol và 0,002% bromophenol)
- Chạy điện di 150V, 40mA
- Sau khi điện di ủ gel trong 20mM Tris/HCl pH 6,8 có chứa 1% Triton X- 100 trong 1h
- Ủ gel trong Natriaxetat 50mM pH5,2 trong 2-3h ở 37ºC - Rửa sạch với nƣớc
- Nhuộm với 0,01% Calcoflour 5-10 phút - Rửa sạch với nƣớc ít nhất 1-2h
- Soi dƣới tia UV
2.4.11. Xác ịnh một số ặc tính c a enzyme chitinase tinh sạch
2.4.11.1. Xác ịnh nhiệt ộ tối u và pH tối u
+ Để tìm nhiệt độ phản ứng tối ƣu, dịch enzyme đã tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất 0,5% colloidal chitin trong đệm citrate photphat 0,1M pH 6,0; ủ hỗn hợp phản ứng ở các nhiệt độ khác nhau từ 20-800C trong 1h. Xác định hoạt tính enzyme bằng phƣơng pháp định lƣợng (mục2.4.4). Đối chứng là mẫu enzyme phản ứng ở 370
C. + Để xác định pH tối ƣu, dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất 0,5% colloidal chitin ở các pH khác nhau (colloidal chitin đƣợc ủ ở các đệm có pH khác nhau từ pH 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9) ở 370C trong 1h. Xác định hoạt tính enzyme bằng phƣơng pháp định lƣợng (mục 2.4.4).
2.4.11.2. Xác ịnh ộ bền nhiệt và ộ bền pH của enzyme chitinase
+ Để xác định độ bền nhiệt của chitinase, tiến hành xử lý enzyme ở các nhiệt độ khác nhau: 30, 40, 50, 60, 70, 800C trong 15, 30, 45, 60 phút. Xác định hoạt độ chitinase bằng phƣơng pháp định lƣợng (mục 2.4.4). Đối chứng là mẫu enzyme không qua xử lý nhiệt.
+ Để xác định độ bền pH của enzyme, dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ ở dung dịch đệm citrat photphate 0,1 M ở các pH khác nhau (pH 3-9) trong 15, 30, 45, 60 phút. Hoạt tính của enzyme sau khi xử lý đƣợc xác định bằng phƣơng pháp định lƣợng (mục 2.4.4). Đối chứng là mẫu enzyme không xử lý pH trƣớc khi phản ứng với cơ chất.
2.4.11.3. Ảnh h ởng của các ion kim loại
Để xác định ảnh hƣởng của các ion kim loại lên hoạt tính chitinase, dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất colloidal chitin 0,5% và dung dịch các ion kim loại Na+
370C trong 1h. Xác định hoạt độ enzyme bằng phƣơng pháp định lƣợng (mục 2.4.4).
2.4.11.4. Khả năng phân cắt cơ chất của chitinase
+ Để xác định khả năng phân cắt của chitinase lên cơ chất, ta tiến hành ủ enzyme với hexose của N-acetylglucosamin trong đệm citrat photphat 0,1M pH 6,0 ở 370C trong 4h-6h, hỗn hợp đƣờng thu đƣợc sau phản ứng đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp chạy sắc ký bản mỏng TLC.
2.4.12. Phân loại ch ng nấm sợi nghi n cứu
2.4.12.1. Xác inh tên loài của chủng nấ bằng hình thái h c
Chuẩn bị mẫu:
La men; Lam kính; Xanh metylen; Đèn đốt bằng ga; Que sắt nhỏ lấy mẫu; Kính hiển vi điện tử
Cách làm
+ Cấy điểm giống nấm sợi từ ống nghiệm thạch nghiêng sang đĩa Petri chứa môi trƣờng LCA, để giống trong tủ 250
C từ 1-2 tuần. + Nhỏ một giọt xanh metylen lên lam kính
+ Hơ que cấy bằng sắt đã khử trùng với đèn đốt bằng gas
+ Làm nguội que cấy, lấy giống trong đĩa petri cho lên lam kính đã có sẵn xanh metylen, đậy lamen lên mẫu
+ Soi dƣới kính hiển vi
+ Tiến hành phân loại chủng nấm bằng phƣơng pháp quan sát hình thái, đo kích thƣớc, chụp ảnh. Sau đó so sánh với khóa phân loại của các tác giả uy tín trên thế giới. Tìm ra sự tƣơng đồng giữa hình ảnh của chủng nấm cần phân loại và hình ảnh trong sách, từ đó đƣa ra kết luận.
2.4.12.2. Ph ơng pháp phân t ch trình t ADNr28S
+ Đệm phá tế bào: 100mM Tris- HCl; 30mM EDTA và 0,5 % SDS (pH8) + 2,5 M kali axetat (pH 7,5)
+ CHCl3-Izoamyl alcohol (24:1 v/v) + 2-propanol
+ 70 % ethanol
+ Dung dịch TE: 10mM Tris-HCl; 1mM EDTA
- Tách ADN tổng số
Chủng nấm sợi đƣợc nuôi trên môi trƣờng PDA ở 280C trong 1 tuần; lấy sinh khối cho vào 100 µl đệm phá tế bào trong ống eppendorf 1,5 ml, trộn đều bằng máy vortex. Đun ở 1000
C trong vịng 15 phút. Thêm 100 µl axetat kali, trộn đều và đặt trên đá 1giờ, ly tâm lạnh 40C ở 15000 vịng/ phút trong 5 phút, lấy phần nổi phía trên. Thêm 200 µl CHCl3-Izoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15000vòng/phút trong 2 phút. Sau đó lấy phần nổi phía trên, làm lại nhƣ vậy lần nữa. Thêm 200 µl 2- propanol (Izo-propanol) và đặt trong tủ đá 20 phút. Ly tâm 15000vòng/phút trong 15 phút và lấy kết tủa. Rửa sạch kết tủa bằng ethanol 70%. Ly tâm 15000 vòng/phút trong vòng 10 phút và lấy kết tủa. Làm khơ tủa trong 10 phút. Hịa tan tủa trong TE (30-50 µl), giữ trong tủ lạnh 40C trong 1 ngày. Giữ ở -200C trƣớc khi sử dụng.
- Thực hiện phản ứng PCR (polymerase chain reaction) + Hỗn hợp phản ứng Đệm 10× Ex Taq Tm 10 µl dNTP mixture (2,5 mM) 8 µl Mồi xuôi (10pM) 1 µl Mồi ngƣợc (10pM) 1 µl
Takara Ex TaqTm(5 unit/ µl) 0,5 µl Mẫu 0,5 µl Nƣớc cất đến 100 µl + Chu trình cho phản ứng PCR
1 94 3 phút
2 Lặp lại chu kỳ sau
94 55 72 30 giây 1 phút 2 phút 30 giây 3 72 10 phút 4 4 - Mồi cho phản ứng PCR
+ Mồi cho phản ứng PCR các vùng ITS-D1D2 ADNr [35,63]: Mồi xuôi ITS1: 5' - TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3' Mồi ngƣợc NL4: 3'- GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 5'
+ Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di. Đun tan 1%agarose trong dịch 1xTAE (dung dịch 50x TAE: 2ml; nƣớc cất: 98ml; agaro:1g) để ấm, đổ vào khuôn đã cắm lƣợc, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di. Lấy 1µl dung dịch 6x đệm nhồi, trộn đều với 1 µl mẫu, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cƣờng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch ethidium bromua (nồng độ 0,5µl/ml) 20 phút, vớt ra quan sát. Quan sát trên máy soi gel.
+ Tinh sạch sản phẩm PCR. Các mẫu sau khi PCR đã đƣợc kiểm tra qua điện di, chọn mẫu có một băng duy nhất và có cùng kích thƣớc với băng xác định trên thang chuẩn.
Các mẫu đƣợc tinh sạch bằng kit QIA gen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1. Trộn đều, đƣa vào cột, ly tâm 13000vịng/phút trong 30 giây. Đổ bỏ dịch phía dƣới cột. Bổ sung 150 µl PE lên
cột. Ly tâm 13.000v/ph trong 30 giây. Đổ bỏ dịch dƣới cột. Ly tâm tiếp 13.000v/ph trong 2 phút. Chuyển cột sang ống eppendoft mới. Thêm 30 µl nƣớc. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 13.000v/ph trong 1 phút. Lấy dịch phía dƣới.
+ Xác định nồng độ ADN: lấy 5µl dịch mẫu đo nồng độ ADN bằng máy đo UV ở các bƣớc sóng 260 và 280 nm. Chọn mẫu có nồng độ > 20µg/ml, độ tinh sạch 1,8.
- Đọc trình tự ADN.
+ Phản ứng khuếch đại mẫu đọc trình tự ADN.
Các sản phẩm PCR tinh sạch đƣợc khuếch đại với bộ kít ABI PRISM Cycle sequencing và đệm 5X giải trình tự ( Perkin-Elmer Appied Biosystem) với hỗn hợp phản ứng:
Terminator Ready Reaction Mix-8µl; mẫu (50µg/ml)-1µl; mồi-1µl; nƣớc cất- đủ đến 20 µl.
+ Mồi cho phản ứng PCR các vùng ITS (Internal transcribed spacer) [63]: Mồi xuôi ITS1: 5' - TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3'
Mồi ngƣợc ITS4: 5' - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3' + Mồi cho xác định trình tự đoạn D1/D2 ADNr 28S [35]:
Mồi xuôi NL1: 5'-GCATATCATAAGCGGAGGAAAAG-3' Mồi ngƣợc NL4: 3'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-5'
+ Chu trình cho phản ứng PCR
Bƣớc tiến hành Nhiệt độ(0C) Thời gian
1 94 1 phút
2 Lặp lại chu kỳ sau
96 50 60 10 giây 5 giây 1 phút
3 4 -
Tinh sạch sản phẩm cho giải trình tự: Mẫu đƣợc chuyển sang ống Eppendoft 1,5 ml. Thêm 5 µl EDTA 1,25 M, thêm 6 µl etanol 100%. Trộn thật nhẹ nhàng. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 15000vòng/phút trong 15 phút. Đổ bỏ dịch phía trên. Rửa bằng 100 µl ethanol 70%. Ly tâm 15000 vịng/phúttrong 10 phút. Làm khơ mẫu bằng máy cô quay chân không trong 3-5 phút.
+ Đọc trình tự ADN: Trình tự của ADNr 28S của chủng nấm đƣợc đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động ABI 3100Avant. Trình tự nucleic của các chủng