Tủ cấy vi sinh vật Nuare (Mỹ)
Cđn điện tử XT 2200C Pressisa (Thuỵ sĩ)
Nồi khử trùng Lequex (Phâp)
Mây lắc thƣờng Gerhardt (Đức)
Tủ ấm 370C Mecmert (Đức)
Kính hiển vi điện tử Olympus BX-51(Nhật Bản)
Mây voltex VELP ( Ý )
Tủ lạnh Sanyo (Nhật Bản)
Mây đo quang phổ 3000 3pro (Nhật Bản)
Mây PCR PE-9700, ABI (Mỹ)
Mây đọc trình tự tự động ABI 3100 Avant (Mỹ)
2.3. MƠI TRƢỜNG
2.3.1. Mơi trƣờng PDA (Potato Dextro Agar) nuôi cấy vă giữ giống (g/l)
lấy dịch); Đƣờng kính: 20; Thạch: 15, Pepton: 5
2.3.2. Môi trƣờng LCA (Low Carbon Agar) ể phđn loại hình thâi học (g/l)
Glucose: 1,0; KH2PO4: 1,0; MgSO4.7H2O: 0,2; KCl: 0,2; NaNO3:2,0; Cao nấm men: 0,2; Agar: 15.
2.3.3. Mơi trƣờng LB (Luria-Bertani)-agar (g/l)
Trypton wasser có sẵn muối: 15g; Cao nấm men: 5g; Thạch: 20g
2.3.4. Môi trƣờng l n men dịch thể (g/l) nghi n cứu chitinase
Thănh phần mơi trƣờng Kí hiệu
0,2% chitin + basal salt mediuma MT1
0,2% chitin + 1% cao nấm men + 1% peptone + 2% dextrose
MT2
0,2% chitin + 2% dextrose MT3
0,2% chitin + 1% cao nấm men MT4
0,2% chitin +1% peptone + 2% dextrose MT5
0,2% chitin +1% cao nấm men +2% dextrose MT6
a:Basal salt medium bao gồm: 0,2% NaNO3 , 0,1% KH2PO4, 0.05% MgSO4.7H2O, 0.05% KCl, 0,001% FeSO4·7H2O, 0,3% sucrose.
2.3.5. Môi trƣờng thử hoạt tính enzyme chitinase tr n ĩa thạch
0,1% cơ chất chitin vă 2% thạch
2.4. PHƢƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU
2.4.1. Phƣơng phâp săng lọc sơ bộ hoạt tính chitinase c a câc ch ng nấm sợi
PDA thạch) để trong tủ ấm 280
C, 5-7 ngăy.
+Dùng ống nhựa vơ trùng đƣờng kính 5mm cắt phần thạch có nấm sợi mọc tốt, chuyển miếng thạch sang môi trƣờng thử hoạt tính phđn giải chitin (mục2.3.5), đặt ở tủ ấm 280
C, 72h.
+ Nhuộm bằng dung dịch đỏ congo (0,1%) trong 2h, sau đó rửa bằng dung dịch NaCl 1M, chủng nấm sợi sinh chitinase phđn hủy chitin, tạo vịng sâng quanh khuẩn lạc, đo kích thƣớc vịng phđn giải, so sânh khả năng phđn giải của câc chủng dựa văo kích thƣớc vịng phđn giải.
+ Chọn câc chủng có hoạt tính phđn giải cơ chất chitin cao nhất.
2.4.2. Phƣơng phâp nuôi cấy nấm sợi sinh tổng hợp chitinase
Câc chủng nấm đƣợc ni cấy trín 25ml mơi trƣờng dịch thể trong bình tam giâc 100ml. Mỗi bình đƣợc thím văo 1ml dung dịch băo tử nấm (106
băo tử/ml), nuôi cấy ở 280C, 200 vịng/ phút. Sau 6 ngăy ni cấy thu dịch enzyme bằng câch ly tđm 10000 vòng/phút ở 40C, 15 phút. Thu dịch nổi để nghiín cứu.
2.4.3. Phƣơng phâp ịnh tính enzyme chitinase
+ Chuẩn bị mơi trƣờng thạch có chứa 0,1% cơ chất (chitin) vă 2% thạch. Khử trùng (121oC/20 phút), thực hiện thao tâc trong phịng cấy vơ trùng, đổ 25ml môi trƣờng ra đĩa petri đê khử trùng, để đơng thạch.
+ Dùng ống nhựa vơ trùng đƣờng kính 5 mm tạo thănh giếng trín mơi trƣờng chứa cơ chất. (Mỗi đĩa thạch tạo 5 giếng/ đĩa: 4 giếng thử hoạt tính, 1 giếng lăm đối chứng đm lă môi trƣờng nuôi cấy).
+ Cho 50μl dịch enzyme văo câc giếng thạch.
+ Để trong tủ lạnh 40C trong 30 phút, sau đó để tủ ấm 370
trong 24h.
+ Nhỏ 10 ml đỏ congo 0,1% nhuộm trong 2h sau đó rửa sạch bằng dung dịch NaCl 1M, đânh giâ hoạt tính enzyme bằng phƣơng phâp đo vòng phđn giải (D- d;mm),trong đó:
D: đƣờng kính vịng phđn giải d: đƣờng kính lỗ thạch.
2.4.4. Phƣơng phâp ịnh lƣợng chitinase[58]
Chuẩn bị hoâ chất
Dung dịch DNS(dinitrosalicylic acid)
- Dung dịch A: cho 880 ml dung dịch DNS 1% vă 255g muối Rochelle văo 300 ml dung dịch NaOH 4,5%.
- Dung dịch B: Cho 10g tinh thể phenol văo 22 ml NaOH 10%. Sau đó thím nƣớc để đạt thể tích 100 ml.
Hoă tan 6,9 g NaHCO3 trong 69 ml dung dịch B, rồi trộn lẫn với dung dich A, để dung dịch trín trong tối 2 ngăy trong một bình sẫm mău trƣớc khi sử dụng (Dung dịch năy có thể sử dụng trong vịng 2 thâng).
Colloidal chitin:
Cho 10g chitin văo 60 ml dung dịch HCl 10N, khuấy đều bằng mây khuấy từ ở tốc độ chậm qua đím tại 40
C.
Bổ sung 500 ml ethanol lạnh, khuấy nhẹ bằng mây khuấy từ qua đím ở 40C. Sau đó ly tđm 10000 vòng/phút để thu kết tủa dạng keo. Rửa kết tủa dạng keo thu đƣợc bằng nƣớc cất nhiều lần cho đến khi pH đạt 7,0.
Lăm khơ kết tủa keo nói trín ở nhiệt độ 800C. Giữ tại 40C cho đến khi sử dụng.
Dung dịch cơ chất:
• 50 mg colloidal chitin trong 10 ml đệm citrate photphat 0,1M pH 6,0. • Ủ hỗn hợp trín ở nhiệt độ 370
C trong vòng 30 phút.
Lấy 2 mg/ml N-acetyl glucosamine cho văo ống falcol vô trùng, lắc đều dung dịch đƣờng. Pha loêng dung dịch N-acetyl glucosamine chuẩn thănh 6 dung dịch có nồng độ khâc nhau nhƣ sau:
Bảng 2.Nồng độ pha loêng N-acetyl glucosamin (mg/ml)
Nồng độ pha loêng
(mg/ml) 0,2 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0
N-acetyl glucosamin
(ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Nƣớc (ml) 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 0
- Lắc đều dung dịch pha loêng
- Cho 0,2 ml dung dịch ở mỗi ống nghiệm trín sang câc ống mới - Thím 0,6 ml dung dịch DNS văo ống nghiệm trín, lắc đều - Giữ nhiệt độ sôi trong 5 phút
- Lăm lạnh nhanh trong dung dịch nƣớc đâ - Pha loêng với 4,2 ml nƣớc cất
- Đo sự hấp thụ ở bƣớc sóng 500nm - Lặp lại thí nghiệm 2 lần
- Dựng đƣờng chuẩn với câc giâ trị đo OD trung bình