2.2.1. Lập hồ sơ bệnh án
Các cặp vợ chồng được chẩn đốn là vơ sinh ngun phát được thăm khám lâm sàng, khai thác tiền sử gia đình (có người nào bị vơ sinh khơng), tiền sử bản thân (có mắc các bệnh mãn tính như viêm gan siêu vi trùng, bệnh đái tháo đường… và có bị chấn thương bộ phận sinh dục hay không), khai thác về tuổi, nghề nghiệp, môi trường làm việc, tiền sử mắc bệnh, nhiễm độc, quai bị, nghiện rượu, thuốc lá.
2.2.2. Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotyp
2.2.2.1. Nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phương pháp của Hungerford D.A. (1960) [55] Hungerford D.A. (1960) [55]
- Lấy 2ml máu tĩnh mạch cho vào ống li tâm đã được tráng bằng heparin và đậy nút cao su kín
- Các bước nuôi cấy phải được thực hiện trong buồng nuôi cấy tế bào trong điều kiện vô trùng.
- Dùng ống hút nhỏ giọt pipet Pasteur cho từ 6 – 8 giọt máu toàn phần vào tuýp ni cấy có chứa 6ml mơi trường ni cấy F10 hoặc F12, 2ml huyết thanh bê và 0,1ml PHA ( phytohemagglutinin).
- Đậy nắp rồi để tuýp nuôi cấy trong tủ ấm 37oC thời gian 72 giờ.
2.2.2.2. Phương pháp làm tiêu bản nhiễm sắc thể
* Xử lý colchicine
- Tế bào nuôi cấy trong tủ ấm đến giờ thứ 70 thì bổ sung vào tp ni cấy 1ml dung dịch colchicine với nồng độ 1µg/1ml để tích lũy nhiều cụm kỳ giữa
- Tuýp nuôi cấy được li tâm với tốc độ 800 – 1000 vòng/1 phút thời gian 10 phút.
- Sau khi ly tâm dùng pipet pasteur loại bỏ dịch nổi ở phía trên giữ lại phần cặn lắng chứa các tế bào
- Cho từ từ 30ml dung dịch nhược trương KCl 0,075 M vào tuýp nuôi cấy - Lắc nhẹ và để trong tủ ấm 37oC thời gian khoảng 45 phút.
- Li tâm, loại bỏ phần dịch phía trên, giữ lại phần cặn chứa nhân tế bào và các cụm NST ở kỳ giữa.
* Cố định tế bào
- Nhỏ từ từ dung dịch cố định Carnoy (3 methanol : 1 acid acetic ) vào tp ni cấy
- Sau đó li tâm loại bỏ dịch nổi ở phía trên (3 lần).
- Lần cuối cùng sau khi nhỏ dung dịch carnoy đem li tâm và loại bỏ dịch ở phía trên giữ lại khoảng 0,5ml dung dịch để nhỏ tiêu bản.
* Lên tiêu bản
- Dùng ống hút nhỏ giọt pipet Pasteur hút lấy phần cặn chứa nhân tế bào và các cụm kỳ giữa và dàn tế bào đều lên lam kính sạch đã được để lạnh.
- Để tiêu bản khô tự nhiên rồi tiến hành nhuộm tiêu bản.
2.2.2.3. Phương pháp nhuộm tiêu bản bằng băng G theo phương pháp của Seabright M. ( 1971) [73] Seabright M. ( 1971) [73]
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất:
Dụng cụ: 5 cốc thủy tinh loại 100ml để đựng hóa chất và thuốc nhuộm, 2 cốc mỏ thủy tinh loại 500ml đựng nước rửa tiêu bản.
Hóa chất: NaCl 0,15N, Trypsin 1: 250 (Difco) KH2PO4, Na2HPO42H2O, Giemsa.
Cách pha hóa chất:
Dung dịch Trypsin mẹ 5%
Dung dịch Trypsin sử dụng: 1 ml dung dịch Trypsin mẹ 49 ml dung dịch NaCl 0,15N Dung dịch đệm photphat KH2PO4 : 3,56g/1 lít
Dung dịch Giemsa 4%: 2 ml dung dịch Giemsa mẹ
48 ml dung dịch đệm photphat pH 6,8
Các bước tiến hành được thực hiện trong điều kiện ở nhiệt độ phịng thí nghiệm: Nhúng tiêu bản vào cốc đựng dung dịch NaCl 0,15N thời gian khoảng 25 – 30 giây.
Sau đó tiêu bản được cho vào một cốc khác đựng dung dịch Trypsin 0,1% (Difco 1: 250).
Rửa tiêu bản lặp lại 2 lần trong một cốc đựng dung dịch NaCl 0,15N.
Tiêu bản được nhuộm bằng thuốc nhuộm Giemsa 4% pH = 7, thời gian 10 phút. Tất cả các tiêu bản sau khi nhuộm xong được rửa trong 2 cốc đựng nước máy hoặc dưới vời nước máy chảy nhẹ. Kiểm tra độ phân vùng của NST dưới kính hiển vi quang học, rồi sau đó để tiêu bản khơ tự nhiên ở nhiệt độ phịng thí nghiệm.
2.2.2.4. Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotyp: theo tiêu chuẩn ISCN (2009) [74] ISCN (2009) [74]
Phân tích NST được thực hiện dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Mỗi cặp vợ chồng được phân tích NST:
- Với tiêu bản nhuộm băng G, chúng tơi phân tích 20 cụm kỳ giữa bao gồm: đếm số lượng NST, phát hiện những bất thường cấu trúc và số lượng của NST. Trường hợp thể khảm có thể phân tích 100 cụm kỳ giữa.
- Tiêu chuẩn đánh giá: quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại x1000, tìm các cụm NST của tế bào đang phân chia ở kỳ giữa. Sau đó chọn các cụm có các NST trải đều trên một diện tích và tạo thành một đám trịn tương đối đều đặn, các NST khơng chồng chất lên nhau có thể phân biệt được từng chiếc và đếm chính xác số lượng NST của từng cụm. Quan sát kỹ và phát hiện những bất thường về cấu trúc và số lượng NST
Lập karyotyp: Mỗi bệnh nhân được chọn 3 cụm kỳ giữa và lập karyotyp trên phần mềm của vi tính theo tiêu chuẩn ISCN – 2009 (An International System for
Human Cytogenetic Nomenclature) .
Tổng hợp các số liệu đã quan sát rồi kết luận về số lượng và cấu trúc của bộ NST.
2.2.3. Xử lý số liệu
Các số liệu phân tích NST và lập karyotyp ở 187 cặp vợ chồng được mã hóa nhập vào máy vi tính, xử lý và kiểm tra độ chính xác bằng các phương pháp thống kê Y học. Số liệu được xử lý và phân tích bằng chương trình Microsoft Excel 2007. Các ứng dụng:
- Các hàm tính tốn: SUM, AVERAGE, STDEV, MIN, MAX…. - Vẽ đồ thị và biểu đồ.
Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong thời gian từ tháng 6/2010 đến tháng 6/2012, tổng số 187 cặp vợ chồng đã được khám lâm sàng tại bệnh viện Phụ sản Trung Ương, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, Khoa sản bệnh viện Bạch Mai… đã gửi đến bộ môn Y sinh học – Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội yêu cầu xét nghiệm NST, phân tích và lập karyotyp, chúng tơi thu được kết quả như sau: